Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

м агаре с Кон А КЖ, которую добавляют и в верхний, и в нижний слой агара в конечной концентрации 20%. Эти клетки можно суб-клонировать также и методом предельных разведений в 96-луночных микропластинах, содержащих по 1-10в облученных аллогенных клеток селезенки на лунку, в присутствии 10% Кон А КЖ.

Для получения клонированных клеток, способных расти в присутствии одного IL-2, суммарную клеточную популяцию необходимо до клонирования поддерживать в течение двух и более месяцев [29, 43]. Например, для получения цитолитических Т-клеток, специфичных к гаптен-модифицированным клеткам, мышей иммунизируют внутрибрюшинно сингенными клетками селезенки, модифицированными гаптеном с высокой степенью замещения. Спустя 10 дней клетки иммунных мышей выделяют и переводят в культуру с облученными гап-тен-модифицированными сингенными клетками селезенки. Клетки, полученные после 10-дневной первичной культуры, рекультивируют с начальной плотностью 105 клеток в 1 мл в присутствии Кон А КЖ и пассируют каждые 4— 6 дней в свежей среде с Кон А КЖ. Плотность культуры поддерживают на уровне от 2-10* до 5-105 клеток/мл. Через два месяца культивирования клетки С. Г. Фэтмен, Ф. В. Фитч

клонируют методом предельных разведений в среде с Кон А КЖ в микропластинах, содержащих по 105 облученных перитонеальных клеток на лунку. Частота клонов, способных к неограниченному росту в среде, содержащей IL-2, значительно выше, если клонирование проводят после нескольких месяцев культивирования суммарной клеточной популяции. Анализ специфичности цитолитического действия клонированных клеток, полученных этим способом, показал, что на самом деле уже такая суммарная популяция становится сама по себе «клонированной» [38].

30.6. Клонирование мышиных Т-лимфоцитов, отвечающих на растворимый антиген

Клонирование Т-лимфоцитов, отвечающих на растворимые антигены, проводят после сенсибилизации клеток антигеном in vivo [43]. Мышей иммунизируют подкожно в основание хвоста соответствующим количеством антигена (обычно 100 мкг растворимого белка), эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда [61]. Через 7 дней готовят суспензию клеток паховых и парааорталь-ных лимфоузлов, затем эти клетки культивируют по 5-10е клеток на лунку 24-луночной пластины в 1,5 мл среды с соответствующим количеством раство^ римого антигена (обычно от 100 до 400 мкг/мл). Спустя 4 дня выделяют живые клетки и по 1,5-105 Т-клеток переносят в лунки 24-луночных пластин, содержащих по 5 • 10е облученных сингенных клеток селезенки в 2 мл среды. Через 7— 14 дней 2-105 живых клеток рестимулируют антигеном в соответствующей концентрации в присутствии 5-10* облученных сингенных клеток селезенки в лунках 24-луночной пластины в 2 мл среды. Такой цикл стимуляции и пассирования повторяют четырехкратно. Через 24 ч после последней стимуляции смесь клеток из лунки смешивают с 0,5%-ным раствором агара (1—2 объема суспензии на 1 объем раствора агара) и наносят на подложку из 0,5% агара. Спустя 7 дней в мягком агаре можно наблюдать колонии, которые затем «выкалывают» и культивируют, как это было описано для аллореактивных клеток. Для субклонирования в мягком агаре в раствор включают 10 % Кон А КЖ. При клонировании методом предельного разведения ограниченное число клеток переносят в среде с 10% Кон А КЖ в лунки 96-луночной пластины, содержащие по 10е облученных сингенных клеток селезенки и антиген в оптимальной концентрации.

Клеточная пролиферация в ответ на антиген в присутствии соответствующих антиген-презентирующих клеток часто используется как единственный показатель иммунологической реактивности нецитотоксических клонированных Т-клеток, специфичных к аллоантигенам или растворимым антигенам. Хелперная активность или образование лимфокинов может служить другим показателем антиген-специфической реактивности Т-клеточных клонов.

Установлено, что клонированные хелпериые Т-клетки поддерживают специфический антительный ответ при их культивировании с содержащими Т-лимфрциты сингенными клетками селезенки в бессывороточной среде в присутствии специфического антигена, с которым реагируют клонированные Т-клетки [62—64]. В ряде случаев наблюдается побочная стимуляция («bystan-der effect*): Т-хелперные клетки оказывают хелперное действие in vitro на В-лимфоциты с другой, совершенно посторонней антигенной специфичностью, но лишь в присутствии обоих антигенов [63, 64]. Показано также хелперное действие на ЦТЛ-ответ при совместном культивировании клонированных хелперных клеток и клонированных ЦТЛ в присутствии аллоантигена [44]. Многие

30. Длительные культуры иммунокомпетентных клеток типы функциональной активности опосредуются культуральной средой, полученной после стимуляции клонированных Т-хелперов специфическим антигеном. Кроме IL-2 в культуральной жидкости были выявлены BCGF [65], колоние-стимулирующий фактор [48, 66], гамма-интерферон [48, 56, 67], фактор, подавляющий миграцию макрофагов, фактор, индуцирующий экспрессию 1а-молекул [55], фактор, усиливающий синтез гистамина [68], и фактор, индуцирующий синтез макрофагами второго и четвертого компонента комплемента [55]. Спектр лимфокинов, продуцируемых индивидуальными клонами, различен: некоторые клоны секретируют множество разных факторов, тогда как другие продуцируют ограниченный набор лимфокинов [48, 55]. Между видом продуцируемых лимфокинов и антигенной реактивностью клонированной клетки корреляции, по-видимому, нет. Как отмечается ниже, некоторые клонированные ЦТЛ также способны продуцировать IL-2 [69].

Для получения клонированных супрессорных клеток было использовано несколько модификаций метода клонирования. Эти модификации сыграли важную роль в повышении выхода супрессорных клонов. К настоящему моменту детально охарактеризован лишь один супрессорный клон [70 ]г. В этой работе Т-клетки иммунных мышей, выделенные фракционированием на найлоновой вате, дважды обрабатывали антителами против Lyt-1 и комплементом или подвергали их положительной селекции на пластиковых чашках, покрытых антителами против Lyt-2. Затем клетки инкубировали на чашках, предварительно покрытых специфическим антигеном. После отмывки неприкрепившихся клеток связавшиеся с чашками клетки снимали энергичным пипетированием и переносили в лунки 96-луночной микропластины, содержащие монослой облученных филлерных клеток. Клонированные клетки поддерживаются в соответствующей кондиционированной среде [40]. Эти клонированные супрессор-ные клетки секретируют белок, специфически подавляющий антительный ответ на бараньи эритроциты [70]. Белок с мол. массой 70 кДа специфически связывается с бараньими эритроцитами. Такое связывание угнетается гликофори-ном эритроцитов барана, но не гликофорином эритроцитов животных других видов. Этот фактор при мягкой обработке папаином дает две субъединицы с различными биологическими функциями [71Ц. Клонированные клетки, поддерживаемые в культуральной среде, содержащей IL-2, постоянно секретируют этот фактор и, по-видимому, не отвечают на антигенную стимуляцию.

30.7 Клонирование человеческих аллореактивных

Т-лимфоцитов

По методу, описанному Бахом и др. [72, 73], для получения аллореактивных Т-клеток человека выделяют популяцию мононуклеарных клеток периферической крови в градиенте плотности фиколл-гипак. Перед клонированием клетки активируют в реакции СКЛ: 5-106 отвечающих клеток и 5-106 клеток-стимуляторов (4000 рад) в 10 мл среды. Через 4 дня методом «l-g» седиментации [74] выделяют бластные клетки. Эти клетки клонируют методом лимитирующих разведений в микропластинах Терасаки (с плотностью 0,2 клетки на лунку) в присутствии 1-10* облученных фидерных клеток в 15 мкл IL-2, полученного при стимуляции фитогемагглютинином лимфоцитов периферической крови человека [36]. Рост клонов обычно отмечается на 11-й день.

1 В последние годы получен ряд хорошо охарактеризованных супрессорных Т-кло-нов. — Прим. перев. С. Г. Фэтмен, Ф. В. Фитч

Из микропластин Терасаки клетки переносят с помощью автоматической пипетки на 20 мкл в U-образные 96-луночные микропластины, содержащие по 200 мкл среды с человеческим IL-2 и 5-104 облученных фидерных клеток. Среду меняют через день, а свежие фидерные клетки добавляют каждые шесть дней. Клоны наращивают в лунках 24-луночных пластин, содержащих (5—10) • 10& облученных (4000 рад) лимфоцитов периферической крови в 1 мл среды с человеческим IL-2. Клетки пассируют каждые 7 дней. Таким способом могут быть получены как цитолитические, так и пролиферирующие аллореактивные клетки.

Процедура, описанная Маллисеном и др. [75, 76], в принципе подобна описанной выше. В качестве источника IL-2 используются клетки миндалин, стимулированные лейкоагглютинином (Leucoa, Pharmacia, Швеция). После первичной СКЛ или после повторной стимуляции во вторичной СКЛ клетки клонируют методом лимитирующих разведений в 96-луночных пластинах, содержащих 5-Ю4 облученных (4000 рад) аутологичных лимфоцитов периферической крови и лейкоагглютинин (1 мкг/мл). Клонированные клетки наращивают в среде, содержащей IL-2 или лейкоагглютинин и лимфоциты периферической крови в качестве фидерных клеток. Так были получены и пролиферирующие и цитолитические клоны. По-видимому, стабильность цитолитической активности клонов выше при клонировании клеток, которые были получены от индивидов, гипериммунизированных ранее против аллоантигенов клеток-стимуляторов [76].

30.8. Клонирование человеческих Т-лимфоцитов, отвечающих на растворимые антигены

Методы, подобные использованным для получения мышиных антиген-реактивных клонов, оказались эффективными и при получении человеческих лимфоцитов [77]. В этом случае суммарную популяцию мононуклеарных клеток периферической крови индивидов, иммунизированных ранее, стимулируют соответствующим антигеном in vitro в течение пяти дней. Затем клетки высевают в мягкий агар, который содержит стимулирующий антиген в нужной концентрации. Клоны наращивают в среде, содержащей человеческий IL-2. Рекло-нирование проводят в мягком агаре, содержащем человеческий IL-2.

30.9. Слияние клеток как способ получения длительно расту

страница 98
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(26.07.2017)