Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

игена [41]. Установлено, что аллореактивные Т-клеточные клоны по неизвестным причинам не чувствительны к повторной стимуляции антигеном в период экспоненциальной фазы роста [45].

Клонированные Т-клетки можно замораживать и хранить в жидком азоте в течение по меньшей мере нескольких лет. Для этого на ранней log-фазе роста клетки центрифугируют и ресуспендируют при 4 °С в среде, содержащей 10% диметилсульфоксида (ДМСО). Выживаемость замороженных клеток выше при наличии в среде по меньшей мере 10% сыворотки. Для замораживания ампулы с клетками упаковывают в пенопластовые коробки и помещают на ночь в низкотемпературный холодильник при температуре —70 °С. Выживаемость клеток выше при хранении ампул в жидком азоте, чем при хранении в низкотемпературном холодильнике. Ампулы с клетками размораживают быстрым оттаиванием в водяной бане при 37 °С. Как только исчезает последний кристаллик льда, клеточную суспензию разводят десятикратным объемом свежей среды при 4 °С [41]. После центрифугирования клетки переводят в культуру, как описано ниже, используя соответствующие условия поддержания клонов.

30. Длительные культуры иммунекомпетентных клеток 30.3. Среды, используемые для клонирования и культивирования

Несколько видов сред используются разными исследователями со сравнимыми результатами. Для культивирования мышиных лимфоидных клеток часто используется среда Игла в модификации Дульбекко (МДСИ, DMEM), иногда с дополнительными питательными добавками. При этом следует использовать среды с высоким содержанием глюкозы (4500 мг/л). Такая среда изотонична крысиной и мышиной сыворотке [52]. Среда RPMI 1640 используется для культивирования и мышиных, и человеческих клеток, однако, хотя эта среда и изотонична человеческой сыворотке, она гипотонична по отношению к мышиной и крысиной сыворотке. При получении клеточных суспензий для последующего культивирования клеток предпочтительнее использовать солевой раствор Хэнкса или другие подобные среды, изотоничные мышиной сыворотке, чтобы предотвратить лизис клеток и образование геля ДНК, который может захватывать клетки. МДСИ в модификации Искова [53] также гипотонична по отношению к мышиной сыворотке.

Культуральная среда для мышиных клеток обычно включает сыворотку эмбриона коровы в концентрациях от 2 до 10% и 2-меркаптоэтанол, как правило, в концентрации 5-10_5М. Культуры человеческих клеток обычно получают в среде, содержащей от 10 до 20% человеческой сыворотки (смесь сывороток от нескольких доноров). Антибиотики, обычно пенициллин (100 мкг/мл) и стрептомицин (100 Ед/мл), используются в тех случаях, когда в культуру переводят клетки, непосредственно полученные прямо от животных. Для улучшения буферных свойств среды могут быть использованы HEPES (25 мМ) и морфолинпропансульфоновая кислота (МПС) (10 мМ).

30.4. Получение культуральной жидкости, содержащей IL-2

Для получения соответствующих препаратов IL-2 используются несколько разных методов. Содержание IL-2 в культуральной жидкости можно просто и быстро определить, измеряя включение 3Н-тимидина IL-2-зависимой линией клеток при последовательных разведениях культуральной жидкости [54]. Активность неизвестных образцов сравнивают с активностью стандартного препарата. Несколько различных индикаторных клеточных линий, которые можно получить в соответствующих лабораториях, дают сравнимые результаты.

Довольно много IL-2 содержится в культуральной жидкости (КЖ) клеток крысиной селезенки, стимулированных конканавалином А (Кон А КЖ) [31, 32]. В Кон А КЖ обычно представлены и другие лимфокины, включая CSF и BCGF [55]. Такие супернатанты используются для исходного клонирования и для поддержания клонированных Т-клеток. Однако в том случае, когда клонированные клетки, полученные в присутствии IL-2, антигена и филлерных клеток, поддерживают в крысиной Кон А КЖ даже в течение нескольких недель, могут возникнуть фенотипические аномалии.

Для получения Кон А КЖ клетки селезенки крыс культивируют с плотностью 1,25-106 клеток в 1 мл среды (МДСИ, RPMI 1640 или другой подходящей среды), содержащей от 2 до 10% сыворотки эмбриона коровы (СЭК, FCS) и 5-10"5М 2-меркаптоэтанола. Кон A (Pharmacia Fine Chemicals, Уппсала, Швеция) добавляют в конечной концентрации от 2,5 до 5 мкг/мл. Через 48 ч С. Г. Фэтмен, Ф. В. Фитч

культуральную жидкость собирают и центрифугируют. Используются также и другие варианты условий культивирования [31, 32]; детали этой процедуры, по-видимому, не существенны.

Надосадочная жидкость вторичных смешанных культур лимфоцитов (СКЛ) также служит удобным источником IL-2 (СКЛ КЖ) [50], однако содержание IL-2 в ней обычно ниже, чем в Кон А КЖ. Для получения СКЛ КЖ [50] ставят первичную СКЛ, культивируя (25—40)-10е отвечающих клеток селезенки мышей с (25 —80)-106 облученных (1400 рад) аллогенных селезеночных клеток-стимуляторов в 15—20 мл среды в пластиковых флаконах (Falcon №3013), поставленных вертикально. Вторичную СКЛ обычно ставят при более низких значениях отношения числа отвечающих клеток и клеток-стимуляторов по сравнению с первичной СКЛ. Например, 5-Ю6 клеток из первичной СКЛ, собранных через 14 дней культивирования, смешивают с 25-Ю6 облученных аллогенных клеток-стимуляторов в 20 мл культуральной среды. Через 48 ч центрифугированием получают культуральную жидкость. Комбинация линий, отличающихся по локусу Mis, дает сильную стимуляцию клеток и более высокое количество IL-2.

Источником IL-2 могут служить некоторые линии клеток мышиной лимфомы. С этой целью клетки LBRM-33 обычно стимулируют ФГА [1]. Соответствующую сублинию опухолевых клеток EL-4 можно стимулировать форболми-ристатацетатом (ФМА) и получить культуральную жидкость с очень высоким содержанием IL-2 [2]. 1 мкг ФМА добавляют на 100 мл среды, содержащей 10* клеток EL-4. Через 48 ч культивирования культуральную жидкость собирают центрифугированием и ФМА удаляют адсорбцией на активированном угле [2]. Такая КЖ может быть использована для поддержания клонов ЦТЛ в присутствии аллогенных клеток-стимуляторов в течение по крайней мере нескольких месяцев без видимых фенотипических изменений (A. Glasebrook, личное сообщение). Другие сублинии EL-4 для получения IL-2-со держащей КЖ можно стимулировать ФГА [57, 58].

Человеческий IL-2 можно получить, культивируя лейкоциты периферической крови или клетки селезенки (5-106/мл) в среде RPMI 1640, содержащей ФГА (РНА-Р, Difco, Детройт, Мичиган, США) в конечной концентрации 0,2%. Через 48 ч КЖ собирают центрифугированием. Человеческий IL-2 можно также получить при митогенной стимуляции клеток Т-клеточной лейкемии человека Jurkat [37]. Недавно получены человеческие Т-Т-гибридомы с постоянной секрецией IL-2 (Е. Engleman, личное сообщение).

Для полной гарантии стерильности IL-2-содержащую КЖ следует профильтровать, но на фильтрах определенных типов, особенно в случае фильтрации небольших объемов жидкости, может быть потеряна некоторая часть активности. Человеческий и мышиный IL-2 можно очистить преципитацией сульфатом аммония с последующей гель-фильтрацией, ионнообменной хроматографией и препаративным изоэлектрофокусированием [31, 59]. Однако выход при такой очистке бывает относительно низким, и для поддержания Т-клеточных линий и (или) клонов в большинстве случаев можно использовать неочищенную КЖ, содержащую IL-2.

30.5. Клонирование аллореактивных Т-клеток

Клоны аллореактивных Т-клеток можно получить из популяции рестиму-лированных клеток селезенки или лимфоузлов, но частота отвечающих клеток значительно повышается, если их сначала стимулировать аллоантигеном в СКЛ

30. Длительные культуры иммунокомпетентиых клеток [49]. Метод предельных разведений представляет собой обычный способ получения цитолитических и нецитолитических клонированных Т-клеток. Если используются нестимулированные Т-клетки, то в лунку микропластины необходимо вносить несколько сотен клеток. При использовании клеток из вторичной СКЛ, полученных через 48 ч культивирования, в микропластины добавляют от 0,1 до 1 клетки в расчете на одну лунку. Клонируемые клетки суспендируют в культуральной среде, содержащей IL-2, обычно Кон А КЖ, и по 100 мкл такой суспензии добавляют в лунки, содержащие по 10° облученных аллогенных клеток селезенки (1400—3300 рад) в 100 мкл среды с 20% СЭК. Дополнительные 50 мкл среды, содержащие 10% СЭК, и 50 мкл IL-2, добавляют в лунки через 4 дня [51].

Кластеры клеток появляются в лунках приблизительно через одну неделю культивирования. Часть клеток из лунок, содержащих пролиферирующие клетки, можно отобрать для прямого определения цитотоксической активности в чувствительном микротесте, основанном на оценке высвобождения 51Сг [60]. Клетки с нужными свойствами наращивают и поддерживают в присутствии аллогенных клеток и СКЛ КЖ. В лунки микропластин (Linbro 76-033-05 или Costar 3524), содержащие 0,5 мл СКЛ КЖ и 6 • 10е облученных аллогенных клеток селезенки в 1 мл среды с 2% СЭК, добавляют от 1,6 до 3,2-10* клонированных Т-клеток в 100 мкл среды. Клонированные клетки пассируют один раз в неделю.

При использовании другого метода пролиферирующие аллореактивные клетки клонируют в мягком агаре после нескольких последовательных рестнмуляции в СКЛ [43]. Через 24 ч культивирования в последней СКЛ от 3-10* до 4-106 клеток ресуспендируют в 1 мл надосадочной жидкости этой культуры и смешивают с 2 мл 0,5%-ного раствора агара (Bacto agar, Difco Laboratories) в том же супернатанте. Эту смесь равномерно наслаивают на фидерный слой из 15 мл 0,5% раствора агара в чашке Петри (Falcon 1005) диаметром 10 см. Спустя неделю на поверхности мягкого агара появляются колонии. Индивидуальные колонии просматривают под инвертированным микроскопом, извлекают пастеровской пипеткой и переносят в лунки 96-луночной микропластины в 0,2 мл свежей среды, содержащие 1-106 облученных аллогенных клеток селезенки на лунку. Клетки из лунок 96-луночной микропластины переносят в лунки 24-луночных микропластин, содержащие 107 облученных аллогенных клеток-стимуляторов в 2 мл среды. Субклонирование таких аллореактивных клеток проводят в мягко

страница 97
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(27.05.2017)