Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

нных лимфобластов. Про-лиферирующие клетки оказались ВЭБ-отрицательными, но обладали свойствами зрелых Т-лимфоцитов. Активное начало КС было названо фактором роста Т-клеток [26].

С этим открытием был сделан решающий шаг к клонированию Т-клеток. Длительные культуры линии мышиных цитотоксических клеток были описаны год спустя [27], а клоны цитотоксических Т-лимфоцитов были получены еще С. Г. Фэт.чен, Ф. В. Фитч

через несколько месяцев [28]. Приблизительно в это же время были получены нецитолитические Т-клеточные клоны при клонировании в мягком агаре без добавления экзогенного TCGF, так как последний продуцировался эндогенно [29]. Через несколько лет после дискуссий на Международном рабочем совещании по лимфокинам, на котором разрабатывалась рациональная номенклатура лимфокинов [301, TCGF был переименован в интерлейкин-2 (IL-2), поскольку многочисленные биохимические и биологические исследования показали, что активность TCGF определяется одной довольно хорошо охарактеризованной молекулой.

Все методы клонирования Т-клеток, используемые в настоящее время, связаны с добавлением IL-2 в культуральную среду. На практике, однако, для получения Т-клеточных клонов большинство последователей использует неочищенную кондиционированную среду или лишь частично очищенный материал. Кондиционированную среду, содержащую IL-2, можно получить при стимуляции мышиных лимфоидных клеток в СКЛ, при митогенной стимуляции крысиных [31], мышиных [32, 33] или человеческих [34—36] лимфоидных клеток или при соответствующей стимуляции отдельных линий клеток лимфомы мыши [1,2] или человека [37]. Во всех этих средах фактором, необходимым для роста Т-клеток, по-видимому, является IL-2. Однако, наряду с IL-2, в кондиционированной среде присутствуют обычно и другие лимфокины, способные вызывать некоторые из наблюдаемых биологических эффектов. Свойства ряда лимфокинов, участвующих в регуляции иммунного ответа, детально рассмотрены Смитом (гл. 21) и здесь не приводятся. Следует, однако, отметить, что довольно рискованно приписывать IL-2 все эффекты, наблюдаемые при культивировании Т-клеток в кондиционированной среде, до тех пор, пока не будут использованы очищенные препараты IL-2. Для удобства в дальнейшем материал, необходимый для роста Т-клеток и используемый для поддержания пролиферации клонированных Т-лимфоцитов, будет обозначаться как «IL-2», но при этом следует учитывать приведенные выше замечания.

30.2. Общие условия клонирования

Для получения и поддержания Т-клеточных клонов используется два значительно различающихся подхода. При первом подходе для стимуляции роста Т-клеток после активации антигеном используется только IL-2. Отвечающие лимфоидные клетки, собранные после стимуляции антигеном in vivo, культивируют в присутствии соответствующего антигена. Затем такие культуры «подкармливают» (периодически обрабатывают) только IL-2. Обычно при таком подходе необходимо пассировать клетки в суммарной культуре в течение нескольких недель до того, как станет возможным с достаточной частотой выделять Т-клеточные клоны, поскольку частота Т-лимфоцитов, способных расти в присутствии одного IL-2, по-видимому, низка [38]. Действительно, культивируемые Т-цлетки, как правило, хорошо растут в течение нескольких недель, а затем наступает «кризис», при котором скорость роста снижается. Культуры затем либо вымирают, либо неожиданно начинают расти значительно лучше. Клетки, пережившие такой кризис, зачастую ведут свое начало от одного клона [38]. Свойства клонированных Т-клеток, полученных и поддерживаемых в культуре в присутствии одного IL-2, могут быть нестабильны; например, у ЦТЛ, полученных таким способом, может изменяться уровень и характер цитолиза [28]. У большинства, если не у всех клонированных Т-клеток, полученных таким методом, выявляются кариотипические изменения [39]. Такие кло-

30. Длительные культуры иммунокомпетентных клеток нированные Т-клетки могут также утратить способность к ответу на специфическую стимуляцию антигеном [40].

Второй подход к получению и поддержанию Т-клеточных клонов сводится к использованию специфического антигена и «филлерных» клеток (клеток-«на-полнителей») наряду с IL-2. С помощью этого метода можно получить аллореак-тивные клоны из первичной СКЛ, а эффективность клонирования из вторичных смешанных культур может приближаться к 100% [41, 42]. При клонировании Т-клеток, отвечающих на «обычные» растворимые антигены, «филлерные» клетки служат источником la-положительных антиген-презентирующих клеток, необходимых для Т-клеточной стимуляции [43]. Аллореактивные клонированные Т-клетки можно стимулировать популяцией облученных прикрепляющихся аллогенных клеток, содержащей макрофаги. Неясно, выполняют ли филлерные клетки какие-либо другие функции, кроме презентации антигена. Во всяком случае, высокая исходная эффективность клонирования и простота поддержания клонированных клеток в культуре связаны с присутствием филлерных клеток, которые представлены в популяции сингенных или аллогенных клеток селезенки, лишенной Т-лимфоцитов [44].

Эти выводы справедливы не |для всех случаев. Антиген-реактивные проли-ферирующие нецитолитические клонированные Т-клетки способны проли-ферировать в присутствии только IL-2, причем этот ответ характеризуется строгой зависимостью доза—эффект [45]. Количество IL-2, высвобождаемого при стимуляции клонированных пролиферирующих Т-клеток антигеном, в свою очередь зависит от числа клеток в культуре [46]. При высокой плотности клеток в ответ на антигенную стимуляцию IL-2 может образовываться в количестве, достаточном для пролиферации клеток. В этом случае отпадает необходимость в экзогенном IL-2. Однако при низкой плотности требуется некоторое количество IL-2 экзогенного происхождения, чтобы «разогнать» клетки до такой плотности, когда IL-2 будет продуцироваться в количествах, достаточных для поддержания клеточного роста. Хотя для роста большинства клонированных линий ЦТЛ необходим экзогенный IL-2 и один лишь антиген не способен индуцировать пролиферацию этих клеток, при культивировании ЦТЛ с аллоанти-геном в присутствии лимитирующих количеств IL-2 отмечается синергическое действие антигена и IL-2 [47]. Клонированные ЦТЛ, по-видимому, способны отвечать на антиген, поскольку после соответствующей антигенной стимуляции могут высвобождаться фактор активации макрофагов (ФАМ), интерферон и некоторые другие лимфокины [48]. Таким образом, и для пролиферирующих, и для цитотоксических клонированных Т-клеток сочетание относительно низкого содержания IL-2, антигена и филлерных клеток является достаточным селективным стимулом для роста клеток, эффективно отвечающих на антиген. Время удвоения клонированных клеток довольно мало — как правило, от 18 до 24 ч [45] — и через несколько недель или месяцев культивирования обычно появляются измененные клетки. Клетки, обладающие определенными ростовыми преимуществами, вскоре становятся доминантными. Хотя, как будет обсуждаться ниже, измененные клоны в некоторых случаях представляют интерес, появление и неожиданная экспансия таких клеток создают значительные трудности. Обычная процедура селекции может свести к минимуму преимущественный рост измененных клеток. Для сохранения клонированными клетками необходимых свойств следует реклонировать клетки каждые несколько месяцев.

Эти два разных подхода к получению и поддержанию клонированных Т-лимфоцитов дают возможность получать клетки, свойства которых могут значительно различаться. Выбор метода зависит от планируемого применения С. Г. Фэт.чен, Ф. В. Фитч

клеточных клонов. Клонированные клетки, растущие в присутствии одного IL-2, обладают тем преимуществом, что не содержат клеток других типов. Однако, как отмечено ранее, такие клетки могут характеризоваться фенотипиче-скими и кариотипическими изменениями. Клонированные клетки, поддерживаемые в присутствии IL-2, антигена и филлерных клеток, по фенотипу и ка-риотипу обычно не отличаются от нормальных клеток, но такие клонированные клетки могут включать некоторые клеточные элементы из популяции филлерных клеток. Обработка филлерных клеток антителами против Thy-1 и комплементом служит гарантией, что единственным источником Т-лимфоцитов в данной популяции будут клонированные Т-клетки. Однако некоторое количество остаточных радиорезистентных клеток других типов может сохраняться. Если необходимо полностью удалить примесь филлерных клеток, то клонированные клетки можно пассировать с большей частотой и при более высокой плотности, чем обычно, добавляя лишь больше IL-2. При этом не происходит видимого изменения фенотипических характеристик в течение нескольких недель культивирования (A. L. Glasebrook, личное сообщение).

Собственно клоны можно получить в результате клонирования методом предельных разведений [41, 49], в мягком агаре [29] или с помощью микромани-пуляционной техники [49]. Если при повторном клонировании все клетки будут обладать одними и теми же заданными фенотипическими свойствами, можно быть уверенным, что культивируемые клетки являются клоном. Можно статистически оценить вероятность распределения клонов при клонировании методом предельных разведений и в мягком агаре, но нельзя быть уверенным в том, что данный «клон», полученный этими методами, не является потомством двух или более клеток. Клонирование с помощью микроманипулятора, в особенности при нескольких реклонированиях, дает наибольшую гарантию истинной клональности.

По каким-то не совсем понятным причинам наилучшие результаты получаются в том случае, если аллореактивные клонированные линии, поддерживаемые в присутствии IL-2, антигена и филлерных клеток, пассируют каждые 7—10 дней. На этих сроках после экспоненциальной фазы роста число клеток в культуре начинает снижаться [51]. Для клеток, отвечающих на растворимые антигены, предпочтительнее могут оказаться более длительные интервалы между пассажами (10—14 дней) [43]. Оптимальные результаты может дать чередование периодов антигенной стимуляции и «отдыха», когда Т-клетки культивируются с облученными сингенными клетками в отсутствие ант

страница 96
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.07.2017)