Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

леток-мишеней, главным образом мышиных селезеночных лимфоцитов, можно получить на полистироловых культуральных чашках, предварительно покрытых поли-Ь-лизином или конканавалином А. При инкубации на таких монослоях суспензии иммунных к аллоантигенам клеток селезенки удаляется существенная часть их функциональной активности РТПХ. Для выяснения способности монослоев В-лимфоцитов адсорбировать в качестве клеток-мишеней лимфоциты, участвующие в РТПХ, культуральные чашки Петри перед нанесением клеток покрывали специфически очищенными антителами к иммуноглобулинам. Такие чашки инкубировали затем с суспензией клеток селезенки. В этих условиях наблюдалось образование клеточного монослоя, более плотного, чем на чашках, покрытых поли-Ь-лизином или конканавалином А [17].

Эта техника получения монослоев В-лимфоцитов оказалась эффективным способом разделения Т- и В-лимфоцитов, которое не связано с лизисом клеток и может быть выполнено препаративно в стерильных условиях [8]. Таким способом проводилось разделение не только мышиных, но и кроличьих лимфоцитов [18, 19].

Если поверхность, покрытая антииммуноглобулиновыми антителами, может связывать В-лимфоциты при взаимодействии с природными поверхностными молекулами иммуноглобулинов, то очевидно, что с такой поверхностью может связываться практически любая клетка, предварительно обработанная in vitro антителами к какому-либо поверхностному маркеру-. Эта процедура является универсальным методом разделения клеток, поскольку дает возможность разделять антиген-положительные и антиген-отрицательные клетки. Такой непрямой метод был впервые использован для отделения относительно зрелых предшественников нейтрофилов от других клеток костного мозга морских свинок [20]. При этом суспензию клеток костного мозга морских свинок инкубировали с кроличьими антителами против нейтрофилов, отмывали от несвязавшихся антител и затем отмытые клетки наносили на культуральные чашки, предварительно покрытые аффинно очищенными антителами против кроличьего иммуноглобулина. Непрямой метод был также использован для получения плотно прикрепленного к субстрату монослоя «неприкрепляющихся» Ig-отрицательных клеток мышиной лимфомы EL4, которые затем были использованы как иммобилизованные мишени для проведения микросъемки последовательной адсорбции и литического действия цитотоксических Т-лимфоцитов Рис. 29.9. Микрофлуориметрический анализ на лазерном сортировщике Т-лимфоцитов мышиной селезенки, разделенных на популяции Lyt-2+ и Lyt-2- путем инкубации обработанной анти^у1-2.2-антителами клеточной суспензии, на полистироловых культуральных чашках Петри, покрытых антииммуноглобулиновыми антителами. А — исходные Ig-отрицательные клетки селезенки; В — обработанные анти-Lyt 2.2-

антителами ^"-клетки селезенки; В — клетки Lyt-2~, неприкрепляющиеся к покрытой антииммуноглобулиновыми антителами чашке; Г — клетки Lyt-2 +, прикрепляющиеся к покрытой антииммуноглобулиновыми антителами чашке. В качестве флуоресцирующего реагента используются меченные флуоресцеином козьи антитела к мышиным иммуноглобулинам.

(ЦТЛ) [21]. В этом случае клетки в суспензии обрабатывали Fab-фрагментами анти- ЕЬ4-антител (чтобы предотвратить кэппирование поверхностного антигена и открепление клеток от покрытой антителами подложки),, отмывали и наносили на чалтки, предварительно покрытые аффинно очищенными антителами против Fab-фрагментов.

Другой областью применения этого принципиального метода оказалось препаративное нелитическое разделение мышиных Т-лимфоцитов, экспресси-рующих (Lyt-2+) и неэкспрессирующих (Lyt-2-) антиген Lyt-2 [221. Разделение Т-клеток Lyt-2+ и Lyt-2 - позволило прямо продемонстрировать синэргизм этих субпопуляций Т-лимфоцитов в развитии РТПХ [22], а также обязательное участие хелперных клеток в генерации предшественников ЦТЛ, отвечающих на аллоантиген in vitro [23]. На рис. 29.9 представлен микрофлуориметрический

29. Разделение и идентификация клеток анализ разделенных клеток Lyt-2+ и Lyt-2-. Описана также менее производительная модификация этого метода, при которой используются бактериологические пластиковые чашки Петри [24].

Вкратце разделение лимфоцитов Lyt-2+ и Lyt-2- [8, 22] осуществляют следующим путем. На первом этапе получают суспензию клеток, не содержащую агрегатов и комков. На стерильно выделенных селезенках делают по нескольку надрезов и затем их продавливают через полиэтиленовое чайное ситечко в культуральной среде, содержащей 10% сыворотки новорожденного теленка. В среду добавляют 0,02 М HEPES ^-2-гидроксиэтилпиперазин-1Ч-2-этансульфо-новая кислота), но не добавляют бикарбонатного буфера, чтобы исключить за-щелачивание среды в ходе разделения. Полученную суспензию клеток центрифугируют, ресуспендируют в изоосмотической среде с низкой ионной силой [26]. В этой среде мертвые клетки и детрит образуют агрегаты, которые удаляют фильтрацией через стерильную марлю. Профильтрованные клетки еще раз центрифугируют, ресуспендируют в свежей среде и подсчитывают. Следующий этап заключается в удалении 1§+-клеток (В-лимфоцитов). Для этого суспензию клеток наносят на культуральные полистироловые чашки Петри диаметром 100 мм, которые предварительно покрывают раствором аффинно очищенных антител к мышиным иммуноглобулинам. Иммобилизированные на чашке антитела связывают В-лимфоциты, оседающие на дно чашки. Через полчаса неприкрепившиеся клетки ресуспендируют легким вращением чашки, переносят на вторую чашку и повторяют эту процедуру. После трех таких инкубации клеток на покрытых антителами чашках популяция неприкрепившихся клеток практически полностью освобождается от В-лимфоцитов (рис. 29.9, А). Теперь она состоит из Ig'-клеток, одна треть которых представлена клетками Lyt-2+, а две трети — Lyt-2" (рис. 29.9, Б). Для разделения клеток Lyt-2+ и Lyt-2-суспензию инкубируют с моноклональными антителами к антигену Lyt-2 при 0 °С. Несвязавшиеся антитела удаляют центрифугированием и клеточную суспензию снова инкубируют с чашками, покрытыми антииммуноглобулиновы-ми антителами, на этот раз при 4 °С. Клетки Lyt-2+, покрытые антителами против Lyt-2, связываются с антииммуноглобулиновыми антителами на поверхности чашки. Клетки Lyt-2- (рис. 29.9, В) собирают, покачивая чашку и отсасывая среду с неприкрепившимися клетками. Чашку затем осторожно отмывают 5 раз забуференным фосфатами физиологическим раствором (ЗФР) и прикрепившиеся клетки Lyt-2+ (рис. 29.9, Г) удаляют энергичным пипетированием среды в чашке.

Эффективность разделения зависит от числа связей, образуемых между ассоциированными с чашкой антителами и мембранно-связанным антигеном, достаточных для того, чтобы клетка оставалась связанной с чашкой, несмотря на силы сдвига, развивающиеся при ресуспендировании неприкрепившихся клеток путем покручивания чашки. В случае таких поверхностных антигенов, как иммуноглобулины, которые присутствуют на В-лимфоцитах в высокой концентрации, проблем со связыванием клеток с подложкой, покрытой антителами, не возникает. В реальных условиях эксперимента такие клетки нельзя выделить, не повредив их. Чтобы снять клетки, чашки покрывают антителами, которые разводят посторонним белком так, что они связываются с поверхностью чашки с меньшей плотностью. Тогда в связывании клеток с чашкой участвует меньшее число связей. В результате можно снять жизнеспособные клетки, о чем свидетельствует их последующее созревание in vitro в антителообразую-щие клетки [8, 27]. Для выделения жизнеспособных В-лимфоцитов можно использовать и другой метод. В этом случае чашки покрывают глобулиновой фракцией гипериммунной антииммуноглобулиновой сыворотки, если концентрация антител составляет в ней по крайней мере 10% от суммарного белка.

С другой стороны, когда антиген представлен на клеточной поверхности в очень низких концентрациях, для эффективного разделения, если оно вообще возможно, необходимо образование максимально возможного числа связей, образуемых аффинно очищенными антииммуноглобулиновыми антителами, которые используются для покрытия чашек. В случае с Lyt-2-антигеном мышиных Т-лимфоцитов конденсация (patching) и кэппинг могут приводить к снижению плотности антигена на поверхности клетки. При этом разделение проходит значительно лучше при 0 °С или при 4 °С [22]. Установлена необходимость такого же температурного режима для успешного разделения субпопуляций человеческих Т-лимфоцитов с использованием ОКТ4- и ОКТ8-антител [25]. Чтобы добиться оптимального разделения клеток, следует эмпирически подобрать подходящее разведение антител к поверхностному антигену. Как ранее отмечалось, моноклональные антитела распознают только одну детерминанту и только с одной аффинностью. Если аффинность такова, что может происходить значительная диссоциация, или если используется избыток антител, то с антигеном будет связан лишь один антиген-связывающий центр молекулы антитела, и диссоциация этой связи приведет к диссоциации всей антительной молекулы. Как ни странно, характеристики разделения ухудшаются в случае использования более низких концентраций антител, когда оба активных центра антитела могут связываться с поверхностным антигеном.

ЛИТЕРАТУРА

1. Мoiler G. Demonstration of mouse isoantigens at the cellular level by the fluorescent antibody technique, J. Exp. Med., 114, 415—434 (1961).

2. Raff M. C. Two distinct populations of peripheral lymphocytes in mice distinguishable by immunofluorescence, Immunology, 19, 637 (1970).

3. Cantor II., Weissman I. Development and function of subpopulations of thymocytes and T lymphocytes, Prog. Allergy, 20, 1—64 (1976).

4. Scher I., Sharrow S. O., Wistar R., Jr., Asofsky R., Paul W. E. B-lymphocyte heterogeneity: Ontogenetic development and organ distribution of B-lymphocyte populations defined by their density of surface immunoglobulin, J. Exp. Med., 14, 494—506 (1976).

5. Osmond D. G., Nossal G. J. V. Differentiation of lymphocytes in mouse bone marrow. I. Quantitative radioautographic studies of antiglobulin binding by lymphocytes in bone marrow and lymphoid tissues, Cell Immunol., 13, 132 (1974

страница 94
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.09.2017)