Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

нтативного расщепления и колоночной хроматографии, б) ультрацентрифугирования антител перед использованием для удаления агрегатов, обладающих высоким сродством к Fc-рецепторам, или в) использования антител такого видового происхождения, которые либо слабо взаимодействуют, либо вообще не способны взаимодействовать с Fc-рецепторами исследуемых клеток. Однако даже если исключены взаимодействия Fc-участков с Fc-рецепторами, антитела будут в разИ. Шер, М. Дж. Мэйдж

личной степени неспецифически взаимодействовать с некоторыми или 'со всеми клетками анализируемой популяции. Это особенно существенно в тех случаях, когда исследуются клетки из популяций, содержащих большое количество незрелых или умирающих клеток, когда конъюгаты антител с флуоресцеином имеют высокое отношение белок/краситель или при использовании техасского красного при анализе по двум параметрам.

При обычной микроскопии неспецифические взаимодействия антител с мертвыми, умирающими или незрелыми клетками можно отличить от специфических взаимодействий по морфологическим характеристикам или по особенностям окрашивания. Так, раздавленная клетка или клетка с внутрицитоплаз-матическим окрашиванием не будет учитываться при микроскопической оценке клеточной популяции. При микрофлуориметрическом анализе ги клетки также можно не учитывать, так как светорассеяние большинства уми ающих или мертвых клеток отличается от светорассеяния жизнеспособных клоток. Однако этот метод не позволяет полностью исключить эти клетки из анализа и, кроме того, существуют неспецифические взаимодействия антител с живыми клетками. Следовательно, для количественной оценки специфических взаимодействий во всех исследованиях, проводимых с использованием метода проточной микрофлуоро-метрии, следует тщательно продумывать и ставить контроли. В большинстве случаев достаточен антительный контроль, так как можно получить посторонние антитела, не взаимодействующие с исследуемыми клетками специфически, но обладающие той же способностью к неспецифическим взаимодействиям, как и антитела, использованные в эксперименте. В случае прямого использования конъюгированных антител соответствующие посторонние антитела в контроле должны быть того же видового происхождения, так же очищены (например, с помощью аффинной хроматографии), обладать сходным отношением белок/краситель и Должны использоваться в тех же концентрациях, что и антитела в опыте (рис. 29.4,А и Б). Если используется непрямой метод, то в контроле клетки следует обрабатывать так же, как и в опыте. Так, на первом этапе используются посторонние антитела того же класса, с тем же соотношением белок/краситель и того же видового происхождения, что и в опыте. Далее клетки, обработанные контрольными или опытными антителами, одинаково окрашиваются вторым реагентом.

В зависимости от свойств использованного в эксперименте антительного реагента могут быть поставлены дополнительные контроли. Например, контроль с клетками конгенных животных дает возможность подтвердить аллоспе-цифичность препарата антител. Аналогично «клеточные» контроли подтверждают органную специфичность антител или специфичность антител к определенному классу лимфоцитов. В качестве примера можно привести отсутствие окрашивания тимоцитов анти-1 g-антителами. Однако клеточные контроли не заменяют контролей с использованием посторонних антител, так как они не .позволяют оценить уровень неспецифических взаимодействий с клетками.

При представлении данных проточной микрофлуориметрии контрольные кривые флуоресценции следует приводить вместе с экспериментальными кривыми и при определении частоты клеток, окрашенных данным реагентом, следует принимать во внимание степень неспецифического окрашивания. Для решения этой проблемы с помощью компьютера получают кривую, представляющую разность между экспериментальной и контрольной кривыми. Если не ясны различия во флуоресцентном окрашивании двух популяций клеток, то получение с помощью компьютера таких кривых («компьютерное вычитание», computer subtraction) является превосходным методом оценки специфического окрашивания.

29. Разделение и идентификация клеток 29.1.4. Сортировка клеток

Для сортировки клеток струя жидкости должна быть разбита на капли в точке ниже точки пересечения струи с лучом лазера. Капли образуются в результате высокочастотной вибрации проточной камеры (40 ООО циклов/с), которую вызывает ультразвуковой генератор (рис. 29.1). Стробоскоп, работающий при той же частоте, что и ультразвуковой генератор, оптически фиксирует капли, так что оператор может с помощью микрометра и серии линз определить расстояние точки отрыва капель от точки пересечения струи жидкости с лазерным лучом (рис. 29.1). Это измерение, а также оценка промежутка между каплями являются критическими для эффективной сортировки, так как по этим характеристикам определяется время, в течение которого на струю жидкости и образующиеся капли подается заряд. Благодаря этому капля, в которой находится клетка, становится определенным образом заряженной. Например, если клетка пересекает лазерный луч и дает сигнал флуоресценции, который по своим параметрам соответствует сортировке «вправо» (отклонению клеток в правом направлении), то капля, в которую попадает эта клетка, при отрыве от струи жидкости должна нести положительный заряд. Это приводит к тому, что капля будет отклоняться вправо при пересечении электрического поля между отклоняющими пластинами. На практике при сортировке заряд подается на три капли, с тем чтобы убедиться, что капля, содержащая данную клетку, отклоняется. Чтобы предотвратить случайные ошибки (наложение капель), электрическая цепь размыкается и заряд перестает подаваться, если вторая клетка следует сразу же за первой. Поскольку капли могут быть заряжены как положительно, так и отрицательно, они могут отклоняться право или влево. Незаряженные капли в электрическом поле не отклоняются и проскакивают прямо.

Ограничение скорости сортировки связано с эффективностью образования капель и проблемами наложения. Образование приблизительно 40 ООО капель в секунду гарантирует, что в одну каплю попадет только одна клетка и что если имеется три заряженные капли, то капля, несущая клетку, будет одной из этих трех. В реальных условиях устанавливается такое давление подачи образца, что при сортировке через прибор проходит 5000 клеток в секунду. При разделении больших клеточных фракций, например при выделении селезеночных В-лимфоцитов мыши, на долю которых приходится, как правило, 50%всей популяции, можно быстро получить значительное количество клеток (50 %Х Х5000 = 2500 клеток/с-3,6-102 с/ч = 9-106 клеток/ч). Проблема решается также с помощью обогащения искомой популяции каким-либо другим методом или с помощью предварительной сортировки на лазерном сортировщике клеток при очень высокой скорости подачи образца. Такая процедура повысит частоту искомых клеток в популяции, которую затем можно разделить на этом приборе при обычных условиях.

Выход клеток при сортировке варьирует в зависимости от источника клеточной популяции и выделяемой фракции клеток. В общем случае выход клеток варьирует от 60 до 90% от числа клеток, которые проходят сортировку. Потери клеток происходят в коллекторных пробирках в результате гибели клеток или в результате неэффективного концентрирования и сбора образца. Чтобы свести к минимуму гибель клеток, их собирают в пробирки, содержащие культуральную среду с белковыми добавками. В ходе сортировки над белковой средой собирается слой клеток в обтекающей жидкости. Эти клетки следует как можно скорее суспендировать в белковой среде и перевести в более разве-

10-0395 И. Шер, М. Дж. Мэйдж

денное состояние. При работе на большинстве приборов стерильность легко достигается с помощью фильтрации обтекающей жидкости, а также стерилизации самого образца, соединительных трубок и проточной камеры.

Пробу каждой выделяемой популяции необходимо повторно проанализировать после окончания сортировки. Это позволяет избежать неудач, связанных с неправильным промечиванием, и, что более важно, служит доказательством эффективности сортировки. При сортировке основных фракций исходной популяции достигается превосходная степень очистки (более 93%). Нефлуорес-цирующие негативные клетки можно очистить до более высокой степени, чем флуоресцирующие позитивные клетки, так как при наложений капель позитивная клетка регистрируется с высокой чувствительностью и капли, несущие одновременно позитивную и негативную клетки, не подлежат сортировке. Исследователей, изучающих функциональные свойства клеток, впечатляет жизнеспособность и активность клеток, выделяемых на лазерном сортировщике. Краситель в небольшом количестве, необходимом для определения фенотипа клеток, как правило, не мешает последующим функциональным исследованиям.

29.2. Разделение клеток на специфически покрытых полистироловых подложках

Использование специфически покрытых полистироловых подложек (поверхностей) для разделения клеток («плэйтинг» — от англ. plate поверхность, пластина) оказалось дешевым и эффективным препаративным методом, обеспечивающим стерильность разделяемых клеточных популяций. Общими условиями при использовании этого метода являются возможность получения из разделяемых клеток моноклеточных суспензий и наличие антител к поверхностному маркеру, представленному на части клеток данной популяции. Этому методу предшествовало применение монослоя клеток-мишеней для изучения иммунного ответа. Кеннеди и Аксельрод [15] использовали покрытую поли-Ь-лизином поверхность для получения монослоев эритроцитов при исследовании бляшко-образующих клеток, синтезирующих антитела. Естественная способность макрофагов к прикреплению к субстрату была использована для выявления прямого цитолитического действия на клетки-мишени Т-лимфоцитов, иммунных к аллоантигенам [16],

При изучении реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ) важно было выяснить, способны ли различные клетки-мишени избирательно связывать ал-лореактивные клетки, участвующие в РТПХ. Было установлено, что монослои к

страница 93
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.09.2017)