Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

льшему числу клеток. Существуют компьютерные программы, позволяющие делить контурные карты на различные

Интенсивность флуоресценции 1

Рис. 29.7. Контурная карта анализа по двум параметрам мышиных клеток селезенки, окрашенных меченными флуоресцеином кроличьими антителами против б-цепей lg мыши (интенсивность флуоресценции 1) и конъюгированными с техасским красным кроличьими антителами против р-цепей lg мыши (интенсивность флуоресценции 2). Представлено три уровня, соответствующих 5, 15 и 25 клеткам.

уровни (группы) с разными осями координат и определять частоту клеток в каждой группе. С помощью этих программ можно определить частоту специфически окрашенных клеток в пределах группы, рассчитывая число клеток на группу в эксперименте и вычитая из него число неспецифически окрашенных клеток, обнаруживаемых в тех же координатах при окрашивании контрольными реагентами.

29. Разделение и идентификация клеток

29.1.2. Приготовление и окрашивание образцов

29.1.2.1. Выделение клеток

Проточные микрофлуориметры анализируют моноклеточные суспензии. Небольшие агрегаты (из двух и более клеток) не мешают анализу, так как их легко можно отличить по характеристикам светорассеяния и исключить из анализа. Однако агрегаты большего размера могут забивать выход проточной камеры. Поэтому критическим моментом для эффективной работы этих приборов является тщательное приготовление клеточной суспензии. В случае использования периферической крови в качестве источника клеток клеточная агрегация не составляет проблемы, так как для выделения клеток используется градиент плотности фиколл-гипака. Клетки, выделенные из лимфоидных органов, способны агрегировать и следует принять меры, чтобы свести образование агрегатов к минимуму. Например, мягкое разрушение органов резиновым скребком (rubber policeman) или кончиком пластикового шприца одноразового пользования позволяет получить хорошие препараты клеток. Если для приготовления моноклеточной суспензии используются металлические сетки, жизнеспособность клеток снижается и тенденция к образованию агрегатов возрастает. Кроме того, исследователи, старающиеся избежать активного разрушения клеток при быстром прохождении клеточной суспензии через иглы с узким диаметром и позволяющие хорошо осесть клеточному детриту, как правило, получают препараты лучшего качества (с более высокой жизнеспособностью и меньшим числом агрегатов), чем те, кто готовит клетки иным образом. В случае низкой жизнеспособности клеток, например при использовании культивируемых клеток или клеток, обработанных цитотоксическими реагентами, превосходные препараты можно получить, работая с клетками, выделенными в градиенте плотности. Образование агрегатов можно уменьшить до приемлемого уровня, не выделяя клетки в градиенте, если пропускать их через найлоновую сетку непосредственно перед анализом. Вообще для анализа лучше всего подходят препараты ядерных клеток, не содержащие эритроцитов, хотя лимфоидные клетки легко отличить от эритроцитов по распределению светорассеяния.

29.1.2.2. Источник антител

Источник антител, используемых в проточной микрофлуорометрии, не имеет критического значения, но исследователям необходимо учитывать, что различия в характеристиках антител могут существенно влиять на результаты анализа. В связи с исключительной чувствительностью проточной микрофлуори-метрии необходимо использовать антитела максимально возможной чистоты. Наиболее подходящий способ очистки таких препаратов представляет аффинное выделение антител, хотя эта процедура зависит от доступности антигена в больших количествах и в растворимой форме. Однако даже после аффинной очистки антитела различного происхождения будут обладать разными свойствами. Например, гетерологичные антитела распознают ряд антигенных детерминант молекулы антигена с разной аффинностью, тогда как моноклональные антитела распознают только одну детерминанту и только с одной аффинностью. Следовательно, прямое окрашивание компонентов клеточной поверхности гете-рологичными антителами, многие из которых будут обладать высокой аффинностью, окажется, по-видимому, ярче и стабильнее, чем окрашивание монокло-нальными антителами. Однако огромные потенциальные возможности моноклоИ. Шер, М. Дж. Мэйдж

нальных антител в выявлении новых епецифичностей (структур) делают эти недостатки не столь существенными.

Выбор источника антител может также влиять на уровень неспецифического окрашивания в результате взаимодействия антител с Fc-рецепторами. Хорошо известна значительная вариабельность в способности Fc-фрагментов антител разных видов взаимодействовать с Fc-рецепторами лимфоидных клеток других видов. Например, Fc-рецептор мыши эффективно взаимодействует с кроличьим Fc-районом, значительно менее эффективно с Fc-районом lg козы и практически не реагирует с Fc-районом lg кур.

29.1.2.3. Прямое или непрямое окрашивание

Независимо от источника используемых антител их присутствие на поверхности клеток может быть определено только в том случае, если они связаны с флуоресцентным красителем. Если антитела доступны в больших количествах, то лучше всего их метить прямой конъюгацией с красителем. Техника такой конъюгации довольно проста. Прямая конъюгация позволяет исследователю окрашивать клетки в один этап, исключая возможность ошибок, вносимых дополнительными этапами, необходимыми для непрямого окрашивания. К ним может относиться увеличение неспецифического окрашивания, поскольку при использовании непрямого метода тенденция к неспецифическому взаимодействию с клеткой у двух антител будет более высокой, чем у одного антитела, используемого при прямом методе окрашивания. Кроме этого, использование в качестве второго реагента конъюгированных с красителем aHTH-Ig-антител может приводить к увеличению неспецифического окрашивания. Например, при окрашивании смешанной популяции лимфоидных клеток мышиными моноклональными антителами IgG-класса против Т-лимфоцитов с последующей обработкой конъюгированными с флуоресцеином антителами против IgG мыши такие меченые aHTH-IgG-антитела способны взаимодействовать с IgG-не-сущими В-лимфоцитами и макрофагами. Таким образом, окрашивание «не-Т-клеток», несущих поверхностный IgG, может искажать результаты. Вероятность таких искажений можно уменьшить, если первое антитело и анализируемые лимфоидные клетки будут получены от представителей различных видов. Тогда на втором этапе можно использовать антитела, специфичные к первому реагенту, но не к lg лимфоидных клеток. Хотя непрямая иммунофлуоресценция может повышать уровень неспецифического окрашивания, тем не менее в этом случае большее количество флуоресцентного красителя может связываться с исследуемыми маркерами, чем при прямом методе. Это обусловлено тем, что большее число молекул флуоресцеина, конъюгировэнного со вторым антителом, может связываться с первым антителом, особенно если второй реагент представляет собой гетерологичное антитело и распознает многие детерминанты первого антитела. В результате увеличивается число молекул антител, связывающихся с исследуемой структурой. В тех случаях, когда общее число молекул на поверхности клетки, прямо связанных с меченым реагентом, настолько мало, что чувствительность микрофлуорометрических систем оказывается низкой для их определения с помощью непрямого окрашивания, в два или даже в три этапа удается выявить эти поверхностные молекулы.

Помимо антител, используемых для анализа клеточных поверхностных структур, существует множество реагентов для количественной оценки содержания ДНК в популяциях лимфоидных клеток. Одним из таких реагентов является митромицин, который, проникая в обработанные спиртом клетки, взаимодействует с ядерной ДНК. Комплексы ДНК с митромицином испускают све-

29. Разделение и идентификация клеток товые волны при возбуждении лучом аргонового лазера с длиной волны 488 нм. Поскольку интенсивность испускаемого излучения пропорциональна количеству ДНК в клетке, то можно определить число пролиферирующих клеток в популяции. Проточные микрофлуориметры с двумя лазерами позволяют исследователю окрашивать клетки антителами, конъюгированными с красителем техасский красный, и идентифицировать данную клеточную популяцию, а также оценивать содержание ДНК в этих клетках. Пример такого исследования приведен на рис. 29.8, где приблизительно 3% клеток в исследуемой популяции

о

Рис. 29.8. Гистограмма флуоресценции мыши- ? ных клеток селезенки после обработки спиртом г-и митромицином (пунктирная линия). Непрерывная линия изображает гистограмму, полученную для той же клеточной популяции, с той лишь разницей, что в этом случае тета-

положительные клетки но анализировали. Интенсивность флуоресценции

находится в фазе S. Если те же клетки пометить антителами против тета (9)-ан-тигена, конъюгированными с техасским красным, и исключить 0+-клетки из анализа, используя их флуоресцентные характеристики, то частота клеток в фазе S возрастает до 13 %. В отличие от этого лишь 1 % 9-положительных клеток находится в фазе S.

29.1.3. Экспериментальные контроли

В связи с высокой чувствительностью метода проточной микрофлуоромет-рии для максимального снижения уровня неспецифических взаимодействий антител с клетками необходимо, чтобы антитела были максимально очищены. Поскольку неспецифические взаимодействия имеют место практически при любой инкубации клеток с антителами, исследователям следует тщательно документировать уровень неспецифических реакций. Такие неспецифические взаимодействия происходят при связывании Fc-участков антител с Fc-рецепторами и (или) при связывании белков, таких как антитела, с клетками в результате мало изученных неспецифических реакций. Неспецифическое связывание этого типа возрастает при получении конъюгатов антител с высокими значениями отношения флуоресцентный краситель/белок или при конъюгации антител с техасским красным в любом соотношении.

Взаимодействия, опосредованные Fc-рецепторами, можно свести к минимуму путем а) выделения F (ав)2-фрагментов антител с помощью ферме

страница 92
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.04.2017)