Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

подхватываются ламинарным потоком обтекающей жидкости и со струей выбрасываются из сопла (выходного отверстия) проточной камеры. Когда клетка в токе жидкости пересекает лазерный луч, он отклоняется. Такой рассеянный свет фокусируется линзой детектора светорассеяния и регистрируется на фотоумножителе. Если клетка несет флуоресцентный краситель, то при пересечении лазерного пучка происходит испускание света в результате возбуждения молекул красителя излучением лазера. Свет, испускаемый клеткой при возбуждении молекул красителя, проходит через фильтр, исключающий регистрацию

лазерного излучения фотоумножителем детектора флуоресценции. Этот фотоумножитель регистрирует излучение, испускаемое клеткой. На основе характеристик светорассеяния и флуоресценции может происходить сортировка клеток. С этой целью под действием ультразвука на проточную камеру струя жидкости «разбивается» на капли. Эти капли могут быть избирательно заряжены при подаче заряда на струю жидкости непосредственно перед образованием капли. Если клетка обладает свойствами, соответствующими отклонению («селекции») в правом направлении, то на струю будет подаваться положительный заряд, как только клетка достигнет точки отрыва капель, и тогда положительно заряженная капля с соответствующей клеткой будет отклоняться вправо при прохождении через заряженные отклоняющие пластины.

по двум параметрам. Другие биологические красители, такие, как акрифлавин, митромицин, бромид этидия и йодид пропидия, характеризуются поглощением в пределах длин волн, испускаемых аргоновым лазером. С помощью этих красителей определяют содержание ДНК в индивидуальных клетках. И. Шер, М. Дж. Мдйдж

29.1.1.1. Сигнал светорассеяния

Когда клетка в токе жидкости встречается с лазерным лучом, свет рассеивается. На величину малоуглового светорассеяния клетками, т. е. на отклонение лазерного луча менее чем на два градуса, влияет размер клеток и показатель преломления. Поскольку эти параметры изменяются при гибели или снижении жизнеспособности клеток, сигнал светорассеяния может быть использован для определения относительной жизнеспособности клеток [14]. На практи-

Иитенсивность флуоресценции

Интенсивность флуоресценции

s

т

Интенсивность флуоресценции

Интенсивность флуоресценции

Рис. 29.2. На фотографиях представлены данные в виде распределения точек на осциллограмме (А), гистограммы светорассеяния (В) и флуоресценции (В, Г). Эти данные получены при исследовании эритроцитов цыплят, фиксированных глутаровый альдегидом. Осцилограмма А свидетельствует о том, что распределение интенсивности флуоресценции эритроцитов цыплят относительно гомогенно, однако эти клетки характеризуются двумя различными величинами интенсивности светорассеяния. Это отражено также и на кривых Б а В, которые представляют независимые гистограммы интенсивности светорассеяния (Б) и флуоресценции (В) для определенного числа фиксированных эритроцитов. Две величи-

ны интенсивности светорассеяния, характеризующие эритроциты цыплят, обусловлены их формой (вогнутый диск) и ориентацией при пересечении лазерного пучка. Если эритроцит пересекает пучок таким образом, что клетка обращена к пучку своим большим диаметром, то эритроцит дает большие значения интенсивности светорассеяния. Если же клетка обращена к лазерному пучку ребром, то светорассеяние менее выражено и отмечаются меньшие значения интенсивности светорассеяния. Повышение напряжения или усиления на детекторе флуоресценции приводит к линейному увеличению регистрируемой интенсивности флуоресценции, как это показано на гистограмме флуоресценции Г.

29. Разделение и идентификация клеток ке луч лазера, прямо проходящий через ток жидкости, блокируется запирающей полоской, которая помещается между линзой и источником света {рис. 29.1). Это приспособление прерывает и отклоняет лазерный луч и, следовательно, предотвращает детекцию сигнала до тех пор, пока клетка не изменит направления лазерного луча. Рассеянный свет, который отклоняется от направления лазерного луча под разными углами и поэтому не блокируется запирающей полоской, регистрируется детектором светорассеяния. Электронные

Светорассеяние

Рис. 29.3. Гистограмма флуоресценции мышиных клеток селезенки. Сплошной линией изображена кривая светорассеяния всей популяции спленоцитов. Лимфоидныс клетки обладают сравнительно гомогенной интенсивностью светорассеяния, тогда как клеточный детрит и мертвые клетки характеризуются более гетерогенным светорассеянием с более низкой интенсивностью. Макрофаги и клеточные агрегаты рассеивают свет в большей степени, чем лимфоид-

ные клетки, и обладают по сравнению с ними более высокой интенсивностью флуоресценции. Анализ характеристик флуоресценции лимфоидных клеток, при котором не учитываются мертвые клетки, клеточный детрит и клеточные агрегаты, связан с исключением из анализа этих частиц на основе их электронных характеристик, так что анализируются только лимфоидные клетки (пунктирная линия).

сигналы, генерируемые детектором рассеяния, усиливаются и представляются на осциллографе в виде распределения точек (dot plot) (рис. 29.2, А) или в виде гистограммы числа клеток с определенной интенсивностью светорассеяния, которую можно построить с помощью анализатора амплитуды импульса (рис. 29.2, Б).

На рис. 29.3 показана кривая светорассеяния, снятая при анализе свежеприготовленной суспензии мышиных клеток селезенки на лазерном сортировщике клеток (ЛСК или FACS — от англ. fluorescence-activated cell sorter). Частицы с очень низкой интенсивностью рассеяния представлены клеточным детритом, мертвые или гибнущие клетки локализуются на отрезке кривой между двумя основными пиками, соответствующими клеточному детриту и живым лимфоцитам. Частицы на участке осциллограммы правее пика лимфоцитов представляют крупные клетки или агрегаты из двух и более клеток. Поскольку сигнал, слабого светорассеяния определяется клеточным детритом и нежизнеспособными клетками, а сигнал сильного светорассеяния определяется агрегатами клеток, оператор может исключить эти частицы из анализа. Это достигается установкой нижней и верхней границы сигнала рассеяния, и тогда «разрешенной» является флуоресценция только тех клеток, которые дают соответствующий сигнал светорассеяния (рис. 29.3). Таким образом, мертвые, а также агрегированные клетки не анализируются и проводится экспериментальный анализ или сортировка только жизнеспособных лимфоидных клеток. И. Шер, М. Дж. Мэйдж

29.1.1.2. Сигнал флуоресценции: анализ по одному или двум параметрам

Линза, фокусирующая рассеянный свет на детектор светорассеяния, расположена прямо по ходу лазерного луча, а линза, фокусирующая сигнал флуоресценции, расположена под углом 90° по отношению к лучу (рис. 29.1). Эта вторая линза фокусирует свет, испускаемый флуоресцентным красителем, который находится на клетках, пересекающих лазерный луч на уровне детектора флуоресценции. Чтобы исключить попадание света лазера на детектор флуоресценции, перед ним помещают фильтр, задерживающий излучение лазера, но не излучение флуоресценции. Электронный сигнал, вызванный попаданием света на детектор флуоресценции, может быть представлен так же, как было описано в случае сигнала светорассеяния (рис. 29.2, А и В). Анализ сигналов, регистрируемых детектором флуоресценции, в масштабе реального времени позволяет оператору выбрать усиление, соответствующее средней интенсивности флуоресценции исследуемых клеток. Усиление определяется напряжением, подаваемым на фотоумножитель. При большем усилении или больших значениях напряжения повышается чувствительность детектора, и профиль флуоресценции сдвигается вправо (рис. 29.2, Г). При использовании линейных усилителей важно так подбирать усиление, чтобы наиболее ярко светящиеся клетки накапливались в самом верхнем канале, хотя следует убедиться, что эти клетки составляют не большую часть всей популяции. В этом случае повышается разрешающая способность флуоресценции. Если существует значительное различие в интенсивности флуоресценции между «бледными» и «яркими» клетками, то логарифмический усилитель повышает расхождение между этими клетками.

В системах с двойной флуоресценцией свет второго лазера фокусируется на струе жидкости несколько ниже точки пересечения с лучом первого лазера. Излучение этого лазера возбуждает свечение второго флуоресцентного красителя, который находится на клетках, проходящих в токе жидкости. Свечение, испускаемое вторым красителем, характеризуется длиной волны, отличной от свечения, испускаемого при возбуждении первого флуоресцентного красителя излучением первого лазера. Это излучение фокусируется той же линзой, которая используется при анализе по одному параметру. Однако в системах анализа по двум параметрам делительная пластинка или дихроичное зеркало направляет половину светового потока на второй детектор флуоресценции. Перед первым и вторым детекторами помещаются фильтры, которые позволяют регистрировать излучение, испускаемое соответствующими красителями. Поскольку луч второго лазера встречается со струей жидкости и, следовательно, с клетками в точке ниже точки пересечения с лучом первого лазера, то электронные сигналы с детектором флуоресценции для этих двух источников поступают в разное время.

Уровень флуоресценции клеток, пересекающих лазерный луч, пропорционален количеству красителя, связавшегося с клетками, и в свою очередь пропорционален величине сигнала, генерируемого на детекторе флуоресценции. Таким образом, величина электронного сигнала, вызванного клетками, служит оценкой количества флуоресцентного красителя на клеточной поверхности, которое отражает число рецепторов/маркеров, выявляемых данным красителем. С помощью конъюгации флуоресцентного красителя с молекулой антитела можно получить пробу, которая позволяет определить частоту практически любого рецептора/маркера, представленного на данной популяции клеток.

29. Разделение и идентификация клеток 29.1.1.3. Хранение, извлечение и представление информации

Электронные сигналы с детекторов свето

страница 90
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.07.2017)