Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

оловины до десятой части всей метки. Затем, оставляя данную концентрацию метки постоянной, следует в отсутствие конкурента разбавить антитела настолько, чтобы отношение концентраций связанного и свободного антигена стало бы близким Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер

к 1,0 (тогда отношение концентраций связанного и суммарного антигена будет равно 0,5). При данных концентрациях антитела и метки чувствительность обычно оказывается близкой к оптимальной с точностью в пределах описанных выше границ. Важно иметь в виду, что при изменении концентрации метки для получения оптимальной чувствительности необходимо соответственно изменить и концентрацию антител.

23.3.3. Анализ данных: графическое и численное представления

Мы уже знаем, как оцределить аффинность с помощью графиков зависимости отношения концентраций связанного и свободного лигандов от концентрации связанного лиганда (график Скэтчарда), свободного лиганда или суммарной концентрации лиганда. Последняя зависимость представляется особенно полезной для обработки данных по конкуренции, получаемых с помощью РИА. Независимой переменной должна быть всегда суммарная концентрация антигена, поскольку она является именно тем известным параметром, при варьировании которого получается стандартная кривая. Обозначим концентрацию

Рис. 23.7. График зависимости B/F или В/Т (отношение концентрации связанного антигена к концентрации свободного или суммарного антигена) от концентрации свободного (F) или суммарного (Т) антигена, когда независимая переменная (F или Т) отложена в линейном масштабе. Сравните с аналогичным графиком, в котором независимая переменная отложена в логарифмическом масштабе (рис. 23.6).

связанного (bound), свободного (free) и суммарного (total) антигена как В, F и Т соответственно. Мы уже видели, что для определения аффинности Касс более удобен график зависимости B/F от F, чем от Т. Однако с помощью РИА определяется именно Т, и поэтому независимой переменной при построении стандартной кривой должна быть тоже Т. Другое отличие ситуации, имеющей место при РИА, от ситуации, которую мы обсуждали ранее, заключается в том, что в первом случае в реакционной смеси присутствуют меченый и немеченый антигены. Зависимой переменной является отношение концентраций связанной и свободной метки B/F, поскольку лишь концентрации меченых реагентов могут быть измерены в РИА непосредственно. Значение B/F для немеченого антигена в условиях равновесия должно быть точно таким же, как и для меченого, если допустить, что тот и другой связываются с антителами одинаково (т. е. с одной и той же Касс). Это допущение не всегда правомерно и требует экспериментальной проверки. Даже если оно окажется неверным, все же с помощью стандартной кривой можно определить неизвестные концентрации, однако любой более детальный анализ становится сложным.

На рис. 23.6 видно, что график зависимости B/F от F или Т в том случае, когда F или Т («доза») отложено в логарифмическом масштабе, имеет S-об-разную форму. То же самое должно быть справедливо для графика зависимости В/Т от F или Т. Отметим, что поскольку В + F = Т, то

В/F или

Б/Т

F илиТ (в линейном масштабе)

(38)

23. Взаимодействие антиген—антитело И

В _ B/F Т — 1 + B/F '

Эти преобразования могут оказаться полезными. Если на графике зависимости B/F или В/Т от F или Т независимая переменная отложена в линейном масштабе, то кривая по форме будет напоминать гиперболу (см. рис. 23.7). График зависимости B/F от логарифма Т был первым способом представления данных,

(39)

Рис. 23.8. Использование координатной системы логит-log для представления данных, полученных с помощью РИА, в виде прямой. В и Т — это концентрации связанной метки и суммарного антигена соответственно, а В0 — это значение В в отсутствие немеченого антигена. Функция логит определяется согласно уравнению (40): логит (У) = In [У/(1 — У)].

1одТ

полученных с помощью РИА. Тем не менее и до сих пор он остается одним из самых информативных. Максимальная чувствительность РИА достигается в условиях, соответствующих наибольшему наклону кривой.

С помощью вероятностного анализа было показано, что, если антиген имеет несколько детерминант, каждая из которых способна связываться с антителом независимо от другой, то чем больше таких детерминант на молекуле антигена может одновременно взаимодействовать с антителами, тем сильнее будет наклон кривой [45]. Такой эффект связывания с несколькими детерминантами обусловлен тем, что в РИА молекула антигена считается связанной, если к ней присоединена хотя бы одна или несколько молекул антитела, а свободной лишь в том случае, когда она вообще не связала антител. Поэтому вероятность того, что данная молекула антигена окажется свободной, равна произведению вероятностей того, что каждая из ее детерминант будет свободной. Данный эффект может приводить к значительному увеличению наклона кривой, что было подтверждено экспериментально [45].

Представить данные в виде прямой во многих случаях позволяет так называемое логит-преобразование [46, 47]. Чтобы его использовать, сначала в каждой точке вычисляют отношение В/В0, где В0 — это концентрация связанной метки в отсутствие конкурента. Затем проводят логит-преобразование полученного отношения, используя следующую формулу:

Логит (Y) = In (-j^r) , (40)

где In означает натуральный логарифм (т. е. логарифм по основанию е). График зависимости логит (В/В„) от In Т, как правило, представляет собой прямую (рис. 23.8). В простейшем случае, когда моноклональные антитела связывают моновалентный антиген, наклон этой прямой обычно равен —1. Очевидно, что представление результатов в виде прямой оказывается весьма полезным при графической интерполяции, которую проводят для того, чтобы с помощью стандартной кривой определить концентрацию антигена. Дополнительное преимущество данного представления заключается в том, что при сравнении прямых линий облегчается тест на параллельность. Если неизвестный антиген идентичен антигену, использованному для получения стандартной кривой,

2-0395 Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер

то в координатной системе логит-log кривая, соответствующая исследуемому антигену, будет параллельна стандартной кривой (конечно же, параллельность кривых не гарантирует идентичности антигенов). Если же антигены не идентичны, то данный тест использовать нельзя.

Эти и другие методы анализа данных, включающие в себя методы статистической обработки, подробно обсуждаются Фелдманом и Родбардом [48], а также Родбардом [37].

23.3.3.1. Поправки к В, F и Т

Перед тем как закончить раздел, посвященный обработке данных РИА, необходимо указать несколько способов контроля и внесения поправок, без которых результаты могут оказаться ошибочными.

Во-первых, в любом методе, использующем преципитацию антител и связанного с ними антигена (или использующем антитела, пришитые к твердой фазе), всегда может существовать фракция антигена, осаждающаяся или связывающаяся неспецифически в отсутствие специфических антител. Поэтому для определения неспецифического или фонового связывания всегда необходимо проводить контрольные эксперименты по связыванию с неиммунной сывороткой (или с другим эквивалентным контрольным препаратом). Неспецифическое связывание обычно линейно возрастает с увеличением дозы антигена. Фракция антигена, обусловливающая такое связывание, должна составлять одну и ту же часть в препаратах как немеченого, так и меченого антигенов, т. е. не может вызывать насыщения. Полученное в этом контрольном эксперименте значение величины связывания следует вычесть из В, а величину F, если она определялась независимо, следует при этом оставить без изменений. Если же F определяется как разность между Т и В (для меченого антигена), то F изменится, поскольку Т в этом случае тоже должно быть скорректировано на величину неспецифического связывания. Другими словами, значение суммарной концентрации антигена представляет собой сумму концентраций связанного специфически и свободного антигена. Весь антиген, который связался неспецифически, следует вычесть из всех выражений, в которые он входит.

Вторая поправка, возможно, менее очевидная, чем первая, связана с наличием радиоактивной метки, не связанной с иммунологически активным антигеном. Во многих случаях меченый антиген загрязнен радиоактивным изотопом, находящимся либо в свободном состоянии, либо в ассоциации с денатурированным антигеном (который, возможно, и денатурировал именно в процессе радиоактивного мечения) или с антигенно неактивной примесью в препарате антигена. Чтобы определить, какая часть радиоактивного материала специфически взаимодействует с антителами в данном конкретном случае, можно использовать раствор с постоянной концентрацией меченого антигена, добавляя в него все увеличивающиеся количества антител. Если загрязнения иммунологически неактивным материалом нет, то при достаточно большой концентрации антител вся радиоактивность должна оказаться связанной. Если же при повышении концентрации антител количество метки, связавшейся с антителами, выходит на плато на уровне, меньшем, чем 100%, то лишь эта часть и будет иммунологически активной. Насколько важно вносить поправки на иммунологически неактивную фракцию, можно показать на следующем примере. Предположим, что часть метки, являющаяся иммунологически активной, составляет лишь 80%, а неактивной — 20%, и пусть истинное значение величины B/F в какой-то точке равняется 3, т. е., согласно уравнению (39), B/F = 0,75. Эти величины относятся лишь к иммунологически активной фракции метки, т. е.

23. Взаимодействие антиген—антитело к 80% метки. Оставшиеся 20%, которые не связываются, будут ошибочно включены в свободную метку, и в результате концентрация свободной метки получится в два раза больше реальной. Это приведет к тому, что рассчитанное значение B/F окажется равным 1,5 (т. е. 0,6/0,4) вместо 3 (0,6/0,2). Такая разница в два раза свидетельствует о существенном различии между истинным значением аффинности и получаемым, например, с помощью а

страница 9
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(29.05.2017)