Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

s P. D., Kearney J. F., Lawton A. R., Cooper M. D. Bone marrow persistence in Д. Ф. Кирней

anti-ц. suppressed mice, conversion to В lymphocytes and recovery following destruction cyclophosphamide, J. Immunol., 120, 1526 (1978).

87. Levitt D., Cooper M. D. Mouse pre-B cells synthesize and secrete ti heavy chains but not light chains, Cell, 19, 617 (1980).

88. Steplewski Z., Herlyn M., Herlyn D., Clark W. H., Koprowski H. Reactivity of monoclonal anti-melanoma antibodies with melanoma cells freshly isolated from primary and metastatic melanoma, Eur. J. Immunol., 9, 94 (1979).

89. Herlyn M., Steplewski Z., Herlyn D., Koprowski H. Colorectal carcinoma specific antigen; Detection by means of monoclonal antibodies, Proc. Natl. Acad. Sci. L'SA, 76, 1438 (1979).

90. Kennett R. H., Gilbert S. Hybrid myelomas producing antibodies against a human neuroblastoma antigen present on fetal brain, Science, 203, 1120 (1979).

91. Chessels J. M., Hardesty R. M., Rapson N. T. Acute lymphoblastic leukemia in children, classification and progress, Lancet, 2, 1307 (1977).

92. Ballou В., Levine G., Hakala T. R., Solter D. Tumor localization detected with radioactiv-ely labeled monoclonal antibody and external scintigraphy, Science, 206, 844 (1979).

93. Uotila M., Engvall E., Ruoslahti E. Monoclonal antibodies to human alpha-fetoprotein, Mol. Immunol., 17, 791 (1980).

94. Miller R. A., Maloney D. J., McKillop /., Levy R. In vivo effects of murine hybridoma monoclonal antibody in a patient with T cell leukemia, Blood, 58, 78 (1981).

95. Miller R. A., Levy R. Response of cutaneous T cell lymphoma to therapy with hybridoma monoclonal antibody, Lancet, 2, 226 (1981).

96. Ritz Pesando J., Saltan S., Clavell S., Notis-McConarty Rosenthal P., Schtossman S. Serotherapy of acute lymphoblastic leukemia with monoclonal antibody, Blood, 58, 141 (1981).

97. Pillemer E., Weissman I. L. A monoclonal antibody that detects a Vx-TEPC-15 idiotypic determinants cross-reactive with a Thy-1 determinant, .T. Exp. Med., 153, 1068 (1981).

98. Volanakis J. E., Kearney J. F. Cross-reactivity between C-reactive protein and idiotypic determinants on a phosphocholine-binding murine myeloma protein, J. Exp. Med., 153, 1604 (1981).

9!). Kilpatrick J. M., Kearney J. F., Volanakis J. E. Demonstration of calcium-induced conformational change(s) in C-reactive protein by using monoclonal antibodies, J. Mol. Immunol., 19, 1159 (1982). 10(1 Blase S. H., Matsumura F., Lin J. J. C. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol, (in press). (1983)

101. Kearney J., Radbruch A., Liesegang В., Rajewsky K. A new mouse myeloma cell line which has lost immunoglobulin expression but permits the construction of antibody secreting hybrid cell lines, J. Immunol., 123, 1548 (1979).

Глава 29

Разделение и идентификация клеток Ирвин Шер, Майкл Дж. Мэйдж

(Irwin Scher, Michael G. Mage)

Развитие методов, использующих антитела для специфического анализа маркеров клеточной поверхности, и последующее выявление с помощью этого подхода [1—4] гетерогенности лимфоидных клеток заложило основу, на которой развивались наши представления о клеточных основах иммунитета. В этих исследованиях обычно использовались два экспериментальных подхода: прямая метка лимфоидных клеток маркированными антителами и лизис клеток-мишеней при обработке их антителами и комплементом. Последний метод позволяет также обогатить клеточную смесь присутствующими в ней лимфоид-ными клетками, не взаимодействующими с антителами, путем лизиса клеток, реагирующих с ними. Хотя комплемент-зависимый цитолиз получил широкое применение в качестве метода количественной оценки и( или) обогащения популяций лимфоидных клеток, у него есть серьезные недостатки, выражающиеся прежде всего в том, что этот метод представляет собой процедуру отрицательной селекции, так как клетки, взаимодействуя с цитотоксической антисывороткой, погибают. Кроме того, клетки с низкой плотностью маркеров/рецепторов могут быть устойчивы к лизису, а клетки с одинаковой плотностью маркеров/рецепторов могут обладать сильно варьирующей чувствительностью к лизису. Следовательно, при использовании этой экспериментальной техники могут иметь место значительные различия в степени обогащения и в оценке числа клеток данной популяции, несущих определенный маркер, к тому же определение чистоты популяции клеток, оставшейся после цитолиза, затруднено, поскольку антитела, присутствующие на нелизированных клетках, могут препятствовать их последующему мечению.

Прямое взаимодействие антитела с лимфоидной клеткой можно продемонстрировать с помощью прямого введения в молекулу антитела радиоактивной, ферментативной или флуоресцентной метки, последующей обработки ими клеток и выявления клеток, связывающих меченые антитела. Эти методы используются во многих исследованиях. Их эффективность и точность при определении частоты клеток, взаимодействующих со специфическим антителом, доказаны убедительно. Однако, за редким исключением [5], эти методы не дают количественной информации о числе рецепторов/маркеров на индивидуальных клетках. Кроме этого, для подобного анализа требуется значительное время, так что количество образцов и общее число клеток, которое может быть исследовано, ограничено и контроли на неспецифические взаимодействия ставятся редко. В этой главе мы опишем два метода, с помощью которых можно, во-первых, оценивать количество антител, связавшихся с клеткой, и, во-вторых, выделять относительно чистые популяции лимфоидных клеток. Проточная мик-рофлуорометрия (ПМФ), представляющая собой метод анализа, для которого необходима сложная аппаратура, используется для быстрого измерения интенсивности флуоресценции большого числа лимфоцитов [6, 7]. С помощью //. Шер, М. Дж. Мэйдж

ПМФ можно также выделять клетки по интенсивности их флуоресценции. Все это дает возможность быстро проводить количественный анализ интенсивности флуоресценции большого числа клеток и образцов, постановку контролей на неспецифические взаимодействия, определение с помощью повторного анализа гомогенности выделенных клеток. Другая экспериментальная техника — разделение клеток на покрытых антителами чашках — не требует сложного оборудования и позволяет разделить большое число клеток по экспрессии маркеров/рецепторов, к которым специфичны селектирующие антитела.

29.1. Проточная микрофлуориметрия 29.1.1. Принципы действия

Развитие метода проточной микрофлуориметрии началось с сообщения Ка-ментского и др. [9] о приборе, измеряющем поглощение света и обратное свето-рассеивание клетками. С помощью этого прибора можно было определять содержание нуклеиновых кислот и размер живых неокрашенных клеток. Примерно в то же время Фалвайлер [10] описал прибор, позволяющий разделять клетки на субпопуляции на основе их поверхностного заряда. Этот прибор основан на технике электростатического отклонения перьевого самописца, описанной Свитом [11]. Впоследствии появился ряд работ, где описаны усовершенствованные модели проточных цитометров с новой техникой ламинарного тока, с использованием лазера, который обеспечивает мощность излучения при данной длине волны, достаточную для измерения флуоресценции [12], а также приборы, анализирующие клетки в струе жидкости в воздухе, а не в проточной кювете. Такие приборы были названы системами с нулевым разрешением, поскольку разрешение, определяемое длиной волны возбуждающего пучка и методом визуализации, оказывается недостаточным для анализа в токе жидкости объектов такого размера как клетка.

Проточный микрофлуориметр анализирует клетки в суспензии в струе жидкости, которую пересекает луч лазера (рис. 29.1). Чтобы сконцентрировать клетки в центральной части струи и уменьшить число агрегатов, способных забить выходное отверстие проточной камеры, используется техника тока обтекающей жидкости («рубашки») (рис. 29.1). Клетки по металлическому патрубку под давлением подаются в проточную камеру, которая промывается током обтекающей жидкости. Обтекающая жидкость с суспендированными в ней клетками выходит из камеры через апертуру, размер которой определяет диаметр выходящего потока жидкости. Частоту поступления клеток в обтекающую жидкость можно варьировать, меняя разницу в давлении между обтекающей жидкостью и вводимым образцом. Этот прием в сочетании с подбором концентрации клеток в образце позволяет создать такие условия, при которых каждая отдельная клетка последовательно проходит точку пересечения лазерного луча со струей жидкости (рис. 29.1).

Источником света в проточных микрофлуориметрах служат лазеры, обычно аргоновые, но встречаются также и гелий-неоновые или криптоновые. Следует подчеркнуть важное значение лазеров в этих системах, поскольку они служат источником высоко коллимированного (параллельные световые волны), монохроматического света большой интенсивности, который можно сфокусировать для передачи значительной энергии анализируемым клеткам. Как правило, аргоновые лазеры настраивают на длину волны излучения 488 нм, что обеспечивает оптимальное возбуждение молекул флуоресцеина, используемого для мечения антител. Если используется техника анализа по двум параметрам, то

29. Разделение и идентификаиця клеток второй лазер фокусируется на струе жидкости несколько ниже точки пересечения лучом первого лазера. Этот второй лазер настраивают на длину волны 568,2 нм, вызывающую максимальное возбуждение молекул красителя техасского красного, который используется для промечивания антител при анализе

Сигнал флуоресценции

Ультразвуковой генератор

/

. Обтекающая жидкость

подачи образца

Фильтр

Линза детентора флуоресценции

4 Лазерный пучок

Линза детектора светорассеяния

Рассеянный свет Запирающая полоска Точна отрыва капель

Сигнал

светорассеяния

Отклоняющие пластины

Рис. 29.1. Схематическое изображение лазерного сортировщика клеток. Клетки поступают в проточную камеру по трубке для подачи образца под давлением, превышающим давление обтекающей жидкости. Клетки

страница 89
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(27.05.2017)