Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

мышиные антитела человеческого, крысиного и кроличьего происхождения [46—49]. Однако использование этих гибридом ограничено из-за быстрой сегрегации хромосом, происходящей после слияния клеток, относящихся к разным видам. При получении межвидовых антителосекретирующих гибридом путем слияния с мышиными миеломами предпочтительно элиминируются человеческие, крысиные и кроличьи хромосомы. Вероятность такой потери хромосом при слиянии клеток, по-видимому, зависит от степени филогенетических различий между соответствующими видами. Причины, вызывающие потерю хромосом, еще до конца не выяснены, хотя может оказаться, что предпочтительная элиминация человеческих хромосом обусловлена их происхождением из сравнительно более медленно растущих родительских клеток. Другой фактор, обусловливающий потерю хромосом, связан с неправильным взаимодействием между хромосомами и нитями «чужеродного» веретена, приводящим к предпочтительной элиминации немышиных хромосом [50]. Однако оказалось, что путем многократного реклонирования, сопровождаемого отбором на каждом этапе антителообразующих клонов, можно получать межвидовые гибридомы, стабильно секретирующие антитела немышиной природы [47, 48]. Наличие крысиной миеломы (табл. 28.3) позволило создать гибридомы крыса—крыса, хотя следует заметить, что стабильность гибридом крыса—мышь обычно и так достаточно высока, и для получения крысиных моноклональных антител можно просто слить иммунные клетки крысы с клетками непродуцирующей миеломы мыши [46].

Сообщения о гибридомах кролик—мышь появляются сравнительно редко и работать с такими гибридомами трудно [49]. Сообщения о получении гибридом с использованием клеток животных других видов, не относящихся к млекопитающим, чрезвычайно редки.

Потеря хромосом у межвидовых гибридом, нежелательная при стремлении получить моноклональные антитела, оборачивается колоссальным преимуществом в тех случаях, когда необходимо выяснить хромосомную локализацию некоторых структурных генов [51]. Например, регистрируя с помощью цитохимических методов элиминацию человеческих хромосом и одновременно проводя их идентификацию, можно связать наличие определенных хромосом с соответствующими фенотипическими признаками. Затем можно локализовать отдельные гены в данной хромосоме. Таким способом в человеческой хромосоме 14 был картирован кластер генов, кодирующих тяжелые цепи [52], а с помощью моди-

28. Гибридомы и моноклональные антитела фицированного метода с использованием кДНК-зондов, взаимодействующих с ДНК этих межвидовых гибридов, была установлена локализация х- и А,-локу-сов легкой цепи в определенных мышиных хромосомах [53—55].

28.3.2. Гибридомы человек-человек

В последнее время появились сообщения о получении ГГФРТ~-линий человеческих В-клеток, которые, по имеющимся данным, пригодны для создания гибридом человек—человек [56—58]. Некоторые из этих линий приведены в табл. 28.4. Принципы получения гибридом человек—человек в основном аналогичны тем, которые используются для получения антителообразующих гибридом грызунов. До сих пор имеется лишь несколько сообщений об успешном конструировании гибридом человек—человек с использованием линий ГГФРТ-. В этих случаях источником лимфоцитов обычно служили клетки селезенки пациентов, сенсибилизированных во время иммунологических тестов [56], или клетки периферической крови больных, страдающих различными заболеваниями [57]. Хотя неясно, почему крупномасштабное производство специфических антителообразующих гибридов человек—человек оказывается не столь успешным, как в случае гибридом грызунов, тем не менее несколько вероятных причин можно указать. Во-первых, используемые для слияния человеческие В-клеточные линии морфологически отличаются от мышиных миеломных линий, обычно происходящих из активно секретирующих иммуноглобулины плазма-цитом, свойства которых аналогичны свойствам зрелых дифференцированных плазматических клеток. Клетки человеческих линий — это лимфобластоидные незрелые и в типичном случае менее дифференцированные В-плазмабласты. Они экспрессируют очень мало цитоплазматических иммуноглобулинов, имеют высокую плотность поверхностных lg- и DB-антигенов (N. Warner, личное сообщение), не секретируют иммуноглобулинов активно и, по-видимому, пролиферируют значительно быстрее большинства клеток мышиных линий. Многие линии, кроме того, экспрессируют вирус Эпштейна—Барр. Возможно, что столь небольшие количества антител, секретируемых гибридами человек—человек, получающимися в результате слияния человеческих антителообразующих клеток с клетками этих линий, объясняются наложением друг на друга низких скоростей секреции, характерных для фенотипов клеток обеих родительских линий. Кроме того, из неопубликованных результатов, полученных в лаборатории автора, с очевидностью следует, что гибридомы человек—человек часто оказываются существенно менее стабильными в плане секреции специфических антител, чем гибридомы грызунов, и значительно труднее поддаются клонированию. Хотя причины подобной нестабильности еще до конца не выяснены, неисключено, что они связаны с различием скоростей пролиферации у нормальных человеческих антителообразующих клеток и человеческих клеток, чувствительных к ГАТ, что в результате приводит к потере соответствующих хромосом (этот вопрос уже рассматривался при обсуждении межвидовых гибридов).

Эффективность методов слияния и выявления антителообразующих клонов для клеток человека и грызунов, по-видимому, одинакова. Не исключено, что значительного увеличения эффективности слияния, клонирования и последующего роста гибридом человек—человек можно добиться, если, как было предложено выше для чисто мышиных систем, к гибридомам добавлять мышиные фидерные клетки.

28.3.3. Т-клеточные гибридомы

Хотя большая часть этой главы посвящена обсуждению гибридом В-кле-точного происхождения, однако имеется много сообщений о Т-клеточных гибри-домах, полученных с помощью различных ГГФРТ-дефицитных Т-клеточных линий, например BW 1547 и EL4 [59—63].

Возможность создания и поддержания в культуре Т-клеточных гибридом, способных секретировать факторы, обладающие многими иммунологическими активностями, помогла выделить среди Т-клеток различные субпопуляции и детально охарактеризовать множество хелперных и супрессорных факторов. Не без основания надеялись, что получение непрерывно растущих Т-клеточных линий и гибридом с антигенной специфичностью, аналогичной специфичности некоторых антителопродуцирующих клонов, таких, как, например, ФХ-специ-фичных идиотип-положительных миелом ТЕРС15, позволит осуществить генетический анализ генов V, участвующих в синтезе антиген-специфичных Т-клеточных рецепторов. Пока между перестройками генов в антиген-специфичных гибридомах и линиях Т-клеток, обладающих аналогичной специфичностью, сходства не обнаружено [64].

При создании Т-клеточных гибридом возникло несколько чисто технических проблем, в силу которых для получения индивидуальных клонов с определенными свойствами Т-клеточные гибридомы ныне используются меньше, чем непрерывно растущие Т-клеточные линии. Т-клеточные гибридомы обладают более выраженной тенденцией к нестабильному вопроизведению желаемых функций. Это может быть обусловлено несколькими факторами, в том числе быстрой элиминацией хромосом из Т-клеточных гибридов [65]. Известно множество разных Т-клеточных субпопуляций, выполяющих различные функции. Возможно, что для непрерывного осуществления какой-либо хелперной или супрессорной функции требуется, чтобы клетки сливающейся линии обладали такими же фенотипическими свойствами, как и нормальные Т-клетки с данной активностью. Клетки линии ВW1547, наиболее часто используемой для гибридизации, имеют фенотип Ly2,3, характерный для супрессорных Т-клеток. Не исключено, что получение других Т-клеточных линий с соответствующим фенотипом облегчит создание в будущем стабильных Т-клеточных гибридом. Следующий фактор, обусловливающий нестабильность воспроизведения желаемых свойств, может быть связан с тем, что, как было показано, для выполнения многих функций Т-клетки должны взаимодействовать с другими Т-клетками или макрофагами. Поскольку после слияния Т-клеточные гибриды клонируются из смеси нормальных клеток, то такие взаимодействия уже могут больше и не иметь места, что иногда будет приводить к утрате интересующей Т-клеточной функции. Тем не менее в последнее время довольно часто стали появляться сообщения о создании стабильных Т-клеточных гибридом [59—63].

28. Гибридомы и моноклональные антитела В большинстве случаев скрининг Т-клеточных гибридом в силу необходимости основывается на эффекте модуляции иммунного ответа в условиях in vitro. В результате процедуры определения активности оказываются сложнее, чем при скрининге специфических моноклональных антител. Более детально эти процедуры описаны в гл. 30 в разделе, посвященном обсуждению вопросов, связанных с клонированием линий Т-клеток и определением их продуктов и функций.

28.4. Примеры использования гибридом

28.4.1. Разнообразие В-клеток

Создание В-клеточных гибридом не только позволило производить специфические моноклональные антитела, но и помогло глубже понять генетические механизмы, обусловливающие разнообразие антител. Как говорилось в гл. 3, пре-В-клетки — первые идентифицируемые элементы В-клеточного ряда — обнаруживаются в эмбриональной печени млекопитающих. Поскольку популяция пре-В-клеток гетерогенна и немногочисленна, анализирвать иммуноглобу-линовый фенотип пре-В-клеток в том случае, когда они берутся из свежевы-деленной печени, довольно трудно [66]. В то же время, получив из пре-В-клеток гибридомы, можно вырастить клоны сравнительно редких клеток [66], что позволяет анализировать экспрессию иммуноглобулиновых генов и синтез иммуноглобулинов. Было показано, что в таких гибридомах гены Fh перестроены, а гены Vb — нет 167, 68]. Это наблюдение подтвердилось в опытах по изучению линий В-клеток, трансформированных вирусом Абельсона, откуда был сделан вывод, что при созревании В-клеток определенный ген Ун может, по-видимому, свободно комб

страница 85
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.07.2017)