Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

эффективными, чем сыворотка плода коровы. Особенно часто неудачи при получении гибридом связаны с инфицированием какого-либо из сливающихся партнеров микоплазмой. В этих случаях вскоре после слияния могут появиться кластеры гибридомных клеток, но затем они перестают расти и в конце концов погибают. Методы обнаружения микоплазмы описаны в работах [41, 42]. Для этой цели существует также целый ряд коммерческих диагностических наборов. Полное описание способов контроля за наличием инфицирующих агентов приведено в книге Хаммерлинга и др. [28].

28.2. Скрининг

Здесь дается лишь общее представление о методах скрининга гибридом и рассматриваются достоинства и недостатки каждого из них. Для более глубокого ознакомления с данным вопросом читатель отсылается к специальным методическим работам [26—29]. Поскольку гибридомы секретируют относительно большие количества антител, то простые, дешевые, удобные и экологически безопасные методы скрининга имеют предпочтение перед высокочувствительными.

В зависимости от того, как предполагается использовать моноклональные антитела, следует выбирать тот или иной способ скрининга. Например, если антитела предназначены для изучения антигена иммунопатологическими методами, то для первоначального скрининга следует выбрать иммунофлуоресцент-ный анализ, а если антитела предполагается использовать в составе твердой фазы в радиоиммунном анализе, то именно этот метод, по-видимому, наиболее удобно использовать и для первоначального скрининга.

Если требуется получить антитела, направленные против компонента, выполняющего какую-либо важную функцию, например против поверхностного мембранного рецептора, то параллельно с тестом на связывание дополнительно можно использовать биологический тест, в котором измерением определенной функции метаболически активной клетки-мишени можно обнаружить моноклональные антитела, специфичные к молекулам, выполняющим эту функцию. Большинство из описываемых методов скрининга можно приспособить для тестирования большого количества гибридом с использованием 96-луночных пластиковых планшетов для микротитрования (клетки при этом могут быть прикреплены к поверхности пластика множеством различных способов). Для снижения трудоемкости скрининга гибридом разработано различное автоматическое

9* Д. Ф. Кирней

и полуавтоматическое оборудование, позволяющее проводить распределение, разбавление, отмывку, а также сбор антител.

Описанные ниже твердофазные методы повсеместно используются при скрининге.

28.2.1. Иммуноферментный анализ (ELISA)

В последнее время большую популярность приобрел метод скрининга, в основе которого лежит использование антител, коньюгированных с ферментом. Согласно данному методу, антиген в разных формах, например в виде раствора, связывается лунками 96-луночного планшета (при этом существенное значение имеют рН и концентрация солей). Лунки тех же самых или аналогичных планшетов, будучи предварительно обработанными глутаральдегидом или поли-L-лизином, могут связать и целые клетки, которые в этом случае будут выступать в качестве иммобилизованных клеток-мишеней. В лунки, покрытые антигенами-мишенями,''добавляют супернатанты из содержащих гибридомы лунок и (после необходимой инкубации) связанные с ферментом антитела, специфичные по отношению к мышиным иммуноглобулинам. Затем после еще одной инкубации и отмывки добавляют субстрат фермента и лунки, содержащие мышиные гибри-домные антитела, связавшиеся с исследуемым антигеном, обнаруживают по появлению яркоокрашенного продукта реакции.

Использование иммуноферментных реагентов имеет определенные преимущества. Конъюгаты легко приготовить, а при соблюдении соответствующих условий их можно хранить в течение длительного времени (2—3 года), так что отпадает необходимость в частом приготовлении новых препаратов, как в случае 1251-меченных антител. Продукт реакции субстрата с ферментом, свидетельствующий о наличии в данной лунке гибридомных антител, может быть обнаружен визуально и без использования дорогостоящего оборудования, необходимого для измерения радиоактивности. Иногда оказывается, что определенный антиген, взятый в качестве мишени, обладает собственной ферментативной активностью. Например, в цитоплазме В-клеток некоторых человеческих линий содержится большое количество щелочной фосфатазы. Если в качестве вторых антител использовать антитела, конъюгированные с щелочной фосфатазой, то будет наблюдаться неприемлемо высокий уровень фона, обусловленный собственной ферментативной активностью В-клеток. В таких случаях можно посоветовать перейти на другой фермент, например 6-галактозидазу или пероксидазу хрена [30]. Методы, подобные иммуноферментному, могут быть приспособлены и для количественного анализа. В продаже имеется несколько высококачественных приборов, с помощью которых можно быстро и точно измерить оптическую плотность в лунках, содержащих субстрат. Использование таких приборов позволяет непосредственно определять содержание антител в супернатантах и сыворотках. Другое очевидное преимущество данного метода по сравнению с радиоиммунным анализом — это возможность избежать опасности загрязнения окружающей среды, возникающей при использовании реагентов, меченных изотопами. Более детальное описание различных иммуноферментных методов и их использования при скрининге гибридом приведено в книге Энгвалла и Песке [30].

28.2.2. Радиоиммунный анализ

Радиоиммунный анализ растворимых белков, полисахаридов, гаптенов, липопротеинов и т. д. проводится в целом по той же схеме, как и иммуноферментный анализ. Однако для измерения радиоактивности содержимого каждой

28. Гибридомы и моноклональные антитела 261

лунки при идентификации клеток, продуцирующих антитела заданной специфичности, обычно применяется гамма-спектрофотометр. В этом случае каждую отдельную лунку, связавшую радиоактивность, необходимо вырезать из планшета. Существует и другой метод, при котором целый планшет можно поместить на рентгеновскую пленку с флуорографическим экраном для сокращения времени экспозиции [43].

Для обнаружения ассоциированных с клетками антигенов могут использоваться и различные варианты радиоиммунного анализа, например прямое связывание антител с суспензией клеток в жидкой фазе. При этом живые клетки оставляют в суспензии для взаимодействия с супернатантами гибридом, а затем их обрабатывают меченными антимышиными lg. После этого измеряют радиоактивность клеточного осадка. Данный метод позволяет обнаружить лишь поверхностные антигены, однако он имеет то преимущество, что позволяет избежать модификации поверхностных компонентов клетки, происходящей при фиксации. Если же клетки связать с лунками, как описано выше, а затем зафиксировать глутаральдегидом, смесью уксусная кислота — этанол или каким-либо иным фиксатором, то можно обнаружить и различные внутриклеточные компоненты [44].

28.2.3. Иммунофлуоресцентный анализ

Благодаря своей высокой специфичности и отсутствию загрязнения другими сывороточными компонентами моноклональные антитела оказались особенно удобными для иммунофлуоресцентного анализа. Поскольку антитела к мембранным компонентам или другим клеточным органеллам, отбираемые на основе описанных выше тестов, не всегда могут быть пригодны для исследований методом иммунофлуоресценции, то в тех случаях, когда они нужны для этого, рекомендуется проводить скрининг также с помощью иммунофлуоресцентных тестов. Конечно, скрининг большого количества супернатантов может занять довольно много времени, однако существует несколько способов, позволяющих сделать эту процедуру менее утомительной. Клетки-мишени могут быть зафиксированы с помощью поли-Ь-лизина или глутаральдегида на микроячейках предметных стекол (Headley Essex Multispot Slide, Shandori Southern Instruments). Такого же эффекта можно добиться, если клетки сорбировать или выращивать на стерильных стеклах в виде монослоя. После соответствующей фиксации (если это необходимо) к клеткам добавляют небольшое количество надосадочной жидкости из каждой содержащей гибридому лунки, и затем клетки, связавшие антитела, выявляют с помощью антимышиных антител, меченных флуоресцентным красителем. Такие микроячейки можно сделать самим, если на предметное стекло наклеить 10—12 полос двусторонней прозрачной липкой ленты параллельно друг другу с интервалами в 2—3 мм и затем накрыть их покровным стеклом размером 22 X 64 мм. В результате получится большое количество микроячеек, в которые, используя капиллярные эффекты, можно внести окрашенные в суспензии клетки. Края микроячеек затем закрывают с помощью лака для ногтей. Просмотр индивидуальных клеточных суспензий может осуществляться путем обычной клеточной микроскопии.

В более сложном анализе для скрининга супернатантов гибридом используется проточный цитофлуориметр [45]. Наличие различного оборудования для работы с микропробами, позволяющего быстро инъецировать многочисленные образцы окрашенных клеток в кювету цитофлуориметра, позволяет быстро анализировать большие количества индивидуальных супернатантов. Эту процедуру можно сделать еще более удобной, если окрашивание клеток-мишеней индивидуальными супернатантами осуществлять в лунках 96-луночного план-

I Д. Ф. Кирней

шета, а стадию отмывки проводить путем одновременного центрифугирования всех 96 образцов в специальных центрифужных адапторах для 96-луночных планшетов. Такой метод анализа, безусловно, будет полезным в тех случаях, когда результаты окрашивания специфическими антителами можно прямо сопоставить с размером клеток или сравнить с результатами окрашивания, проводимого с помощью каких-либо других моноклональных антител, меченных другим флуоресцентным красителем, так же как и с другими параметрами, измеряемыми с помощью проточного цитофлуориметра.

28.3. Другие гибридомы

28.3.1. Гетерогибридомы

Большой интерес представляет возможность получения моноклональных антител от других видов (т. е. не мышиных), и имеются сообщения об использовании мышиных миеломных клеток для создания межвидовых гибридом, секретирующих не

страница 84
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(26.09.2017)