Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

Мышей линии BALB/c иммунизируют антигеном подкожно

Слияние

Очистка моноклональных антител с помощью аффинной хроматографии

Очищенные моноклональные антитела

Гибридомы

Ад8.653

клетки лимфатического узла

Тестирование клонов с по: мощью имыуноферментного анализа Реклонироваиие

Гивридомиые клетки \

,Асциты —

1. Лунки планшета покрыты антигеном

1. В лунки добавлен раствор, содержащий щелочную фосфатазу, сшитую с козьими антимышиными и.-,т1-72a172b;'rЗ;a-,k-;л-, антителами или с козьими антимышиными lg

Рис. 28.3. Различные этапы получения моноклональных антител.

слияния могут отличаться от описанной по различным параметрам, однако существует одно общее правило: лучше использовать какую-то одну из них, а не сочетание нескольких.

1. Суспензии клеток селезенки или лимфатического узла, выделенных из иммунизированной мыши, получают стандартным способом в «ледяном» забу-ференном фосфатами физиологическом растворе.

2. Клетки миеломы выращивают в среде RPMI-1640, содержащей инакти-вированную нагреванием сыворотку эмбриона коровы (10—20%), пенициллин (100 ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), амфотерицин (0,25 мкг/мл) и 2-меркаптоэтанол (5х10-5М). Такая среда называется полной средой. Она же используется и для добавления ГАТ-ингредиентов. Клетки миеломы, находящиеся в логарифмической фазе роста, собирают и отмывают однократно безсывороточной средой RPMI-1640.

3. Равные количества миеломных и лимфоидных клеток смешивают и дважды отмывают путем центрифугирования в бессывороточной среде RPMI-1640 при 1000 g и 37°С.

4. К осадку клеток, разбитому с помощью легкого потряхивания центрифужной пробирки, добавляют 1 мл предварительно нагретого 40%-ного раствора ПЭГ. Клетки инкубируют около 1 мин в присутствии ПЭГ, который затем медленно разбавляют безсывороточной средой RPMI, добавляемой по каплям (5 мл в течение первых пяти минут, и затем более быстро еще 15—20 мл). После этого клетки центрифугируют при 1000g и осторожно переносят с помощью пипетки во флакон, содержащий предварительно нагретую среду ГАТ

5. На этой стадии к слившимся клеткам могут быть добавлены сингенные фидерные (питающие) клетки. Их получают, инъецируя 5—8 мл полной среды

28. Гибридомы и моноклональные антитела в брюшную полость неиммунизированной мыши. При обратном изъятии большей части этого объема отбирается такое количество перитонеальных макрофагов, которое достаточно для получения примерно 120 мл среды, содержащей фидерные клетки. Другими источниками фидерных клеток служат нормальная селезенка и тимус.

6. Плотность полученной смеси доводят до (1—5) • 105 клеток/мл, после чего по 1 мл суспензии осторожно разливают в лунки 24-луночного планшета.

28.1.7. Выращивание гибридом в культуре

В первое время наличие большого количества клеточных обломков, а также несинхронность гибели в среде ГАТ неслившихся миеломных клеток затрудняет обнаружение гибридных клеток. Однако через 7—$ дней начинают появляться небольшие кластеры клеток, имеющих типичную морфологию гибридом. В зависимости от изначальной плотности клеток в рассеваемой смеси в каждой лунке может оказаться один или более кластеров. В этот период надо следить не только за ростом гибридов и изменением цвета среды в лунках, но также и за наличием зараженных лунок, которые необходимо соответствующим образом обрабатывать. При использовании 96-луночных планшетов через каждые 2—3 дня необходимо проводить «подкармливание». Для этого из каждой лунки следует отбирать половину среды и заменять ее равным объемом свежей полной среды.^Вплоть до 14—21-го дня после слияния в среде должен содержаться ГАТ. Затем полезно постепенно разбавлять среду ГАТ, заменяя ее нормальной средой, ибо резкий переход от ГАТ к «чистой» среде может вызвать преждевременную гибель гибридных клеток. Когда кластеры гибридных клеток достигнут размера 2—3 мм в диаметре, супернатанты можно будет тестировать на наличие антительной активности. Иногда при использовании высокоиммуногенных антигенов при скрининге наблюдается высокий уровень фона, обусловленный антителами, синтезированными нормальными плазматическими клетками, которые не слились, но оказались в лунках на начальной стадии и продолжали секретировать антитела в течение нескольких дней после рассева. Эти остаточные антитела негибридомного происхождения можно удалить до проверки на активность, если при «подкармливании» хотя бы один раз полностью сменить среду и провести анализ через 1—3 дня — время, необходимое для того, чтобы в среде появилось достаточное количество антител, секретированных гибридомой.

Тестирование гибридом на наличие антительной активности можно проводить различными способами (см. ниже), однако клоны, обнаруживающие соответствующую специфичность, необходимо реклонировать как можно раньше, а часть клеток исходного клона должна быть заморожена. Реклонирование требуется по уже известным причинам, связанным с возможностью «выброса» хромосом и необходимостью отделения ненужных клеток.

Для реклонирования можно использовать следующий путь: клетки суспендируют в полужидком агаре, и эту суспензию наносят на слой агара, содержащий фидерные клетки, с последующим отбором кластеров, образовавшихся из отдельных клеток. Тестирование реклонированных гибридом на активность антител производят после роста клонов в жидкой среде. Однако наиболее предпочтительный с точки зрения легкости и удобства метод — это клонирование путем лимитирующего разведения в 96-луночных планшетах. Он заключается в следующем: клетки разбавляют и рассеивают их вместе с соответствующими фидерными клетками в такое количество лунок, чтобы рост гибридом наблюдался примерно в 1/3 лунок. Теоретически этого можно добиться, подсчитав количество клеток в исходной лунке и таким способом определив необходимое разбавлеД. Ф. Кирней

ние, однако такой подход не всегда дает хорошие результаты из-за наличия индивидуальных различий между гибридомами по эффективности роста, потребности в фидерных клетках и т. д. Для того чтобы пробы отбирались лишь из лунок, получивших оптимальное количество клеток, успешно применяют следующую эмпирическую схему.

1. Из полной среды RPMI-1640 готовят разбавляющую среду, содержащую перитонеальные фидерные клетки (5-104/мл), полученные от нормальной мыши соответствующей линии.

2. К 30 мл данной среды добавляют 1—2 мкл суспензии гибридомных клеток. Такое небольшое количество клеточной суспензии лучше всего переносить с помощью простерилизованных пластиковых наконечников.

3. Используя 5-миллилитровые пипетки или диспенсер, рассевают по 0,2 мл полученной смеси в лунку 96-луночного планшета.

4. В результате остается около 10 мл содержащей гибридомы среды, которую снова разбавляют 20 мл полной среды и засевают другой 96-луночный планшет. Повторив эту процедуру 2—3 раза, можно быть уверенным, что по крайней мере в одном планшете клоны будут встречаться достаточно редко и что в каждой лунке будет содержаться потомство лишь какой-то одной гибридомной клетки.

После того как реклонированные гибридомы вырастут, супернатанты из лунок, содержащих клоны, снова тестируют на наличие антител и их специфичность. После выявления позитивной реклонированной гибридомы ее можно наращивать (опять же используя фидерные клетки) в культуральных флаконаА увеличивающихся размеров.

28.1.8. Получение моноклональных антител

В зависимости от того, каким образом планируется использовать моноклональные антитела, их можно выделять множеством различных способов.

При росте гибридом в культуре в супернатантах обычно содержится 10-— 100 мкг/мл чистых моноклональных антител. Их можно использовать без дополнительной очистки (возможно, после некоторого концентрирования) в качестве первых антител для непрямой флуоресценции или при иммунопреципитации. Если необходима дальнейшая очистка антител от присутствующих в культуральной среде сывороточных белков, то можно использовать аффинную хроматографию на сефарозе, конъюгированной с козьими или кроличьими антимышиными lg или белком А. Если требуются большие количества антител, то гибридому можно выращивать в виде трансплантируемой опухоли у мышей гистосов-местимой линии. При этом необходимо предварительно (в период от трех дней до одного месяца до инъецирования) ввести мыши внутрибрюшинно 0,5 мл минерального масла, например пристана (Pristane — Aldrich Chemical, Co., Milwaukee).

В асцитах накапливается большое количество антител (1—25 мг/мл), которые затем можно очистить с помощью аффинной хроматографии на сефарозе-4В, конъюгированной с соответствующим антигеном или путем обычной ионообменной хроматографии с последующей гель-фильтрацией. Очищенные антитела следует хранить в забуференном боратом физиологическом растворе, содержащем какой-либо консервант, например 0,1 % азида натрия, при 4°С, так как повторяющиеся циклы замораживания — оттаивания, судя по всему, пагубно влияют на стабильность мышиных моноклональных антител.

28.

Гибридомы и моноклональные антитела 28.1.9. Причины неудач при получении гибридом

Получение гибридомы включает в себя множество in vivo и in vitro этапов, а каждый дополнительный этап —¦ это, как известно, еще один источник ошибок. По-видимому, наиболее часто неудачи в получении гибридом связаны с отступлением от устоявшихся методик работы с культурами тканей. Эти методики предусматривают наличие должного внимания к качеству и чистоте используемой для культивирования посуды, стерильности сред, контролю за влажностью и рН в инкубаторах для клеток. Типы сыворотки, добавляемой в культураль-ные среды, также имеют важное значение, поскольку некоторые серии сыворотки плода коровы не способны поддерживать рост гибридных клеток. Многие фирмы поставляют сыворотку плода коровы, проверенную на способность поддерживать рост гибридом. Для проведения слияния и поддержания в культуре полученных гибридов используются цельная и очищенная от иммуноглобулинов лошадиные сыворотки [40], однако для получения первичных гибридом они обычно оказываются менее

страница 83
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.07.2017)