Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

миеломной линии с последующим культивированием их в среде, содержащей токсичные аналоги азотистых

Основные пути Биосинтеза пуринов и пиримидинов

Запасные пути

Гипоксантин <РРП<р

или -,

гуанин ГПРРТ

Тимидин

АТР

ТК

Рис. 28.2. Основные и запасные пути биосинтеза ДНК. Токсичные аналоги азотистых оснований, приведенные в табл. 28.1, вовлекаются в биосинтез ДНК через запасные пути. В клетках мутантных линий, дефектных либо по тимидин-киназе (ТК), либо по гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтранс-феразе (ГГФРТ), эти основания не вовлекаются в биосинтез ДНК и не оказывают токсического действия. Ввиду отсутствия

Аминоптерин

Ривонуклеотиды

ДезоксириБонукле от иды

-ДНК

необходимых ферментов эти мутанты не способны расти в условиях, когда основные пути синтеза пуринов и пиримидинов заблокированы аминоптерином. В результате на среде ГАТ смогут выжить лишь те гибридные клетки, в которых содержится нормальное количество ТК и ГГФРТ, полученных от родительской В-клетки, а все неслившиеся миеломные клетки погибнут. ФРПФ—фосфорибозилпирофосфат.

оснований. Некоторые из таких аналогов и соответствующие ферменты приведены в табл. 28.1. В среде, содержащей токсичные аналоги, смогут выжить

Таблица 28.1. Токсичные аналоги азотистых оснований и соответствующая ферментативная недостаточность

Аналоги Нарушенная ферментативная активность

6-тиогуанин ¦) 8-азагуанин J Бромдезоксиуридин Гипоксантин-фосфорнбозилтрансфераза Тимидин-киназа

только мутантные клетки, лишенные функционально активных указанных ферментов. С помощью таких сред можно выявлять, клонировать и в конечном итоге выделять клетки, дефектные по тимидин-киназе (ТК-) или по гипоксан-тин-гуанозин—фосфорибозилтрансферазе (ГГФРТ-, HGPRT-).

Эти мутантные миеломные линии и служат партнерами для слияния, поскольку на их фоне легко отобрать гибриды, если заставить клетки ТК- или ГГФРТ- использовать запасной путь синтеза нуклеотидов. Последнее достигается путем добавления в среду аналога фолиевой кислоты, аминоптерина, блокирующего нормальный путь синтеза пуринов и пиримидинов, как показано на рис. 28.2. В этом случае клетки миеломы оказываются вынужденными использовать запасной путь, но, будучи лишены одного из необходимых ферментов, погибают в среде ГАТ.

Генетические дефекты клеток мутантных линий никак не проявляются при росте таких клеток в нормальной среде, так как отсутствующие ферменты

28. Гибридомы и моноклональные антитела участвуют только в реакциях запасного пути синтеза нуклеотидов, а в нор мальных условиях в нем нет необходимости. Клетки же селезенки синтезируют полный набор ферментов запасного пути, так что гибриды, образовавшиеся при слиянии с ГГФРТ" или ТК" миеломными клетками, продуцируют в результате достаточно ГГФРТ или ТК для того, чтобы выжить в среде ГАТ, содержащей гипоксантин и тимидин. Таким образом, в этой среде погибают неслившиеся клетки миеломы, а их гибриды с нормальными клетками продолжают расти. Что касается нормальных В клеток, то in vitro они имеют лишь ограниченное время жизни, поскольку не трансформируются и не пролиферируют и вскоре гибнут.

28.1.2. Ревертанты

Полученные таким способом мутантные миеломные клетки в принципе могут в результате обратной мутации восстанавливать свою ферментативную активность, превращаясь в клетки-ревертанты, нечувствительные к среде ГАТ. Для устранения возможности появления подобных ревертантов, растущих быстрее истинных гибридом, полученных путем слияния, полезно либо выращивать миеломные клетки в присутствии соответствующего токсичного аналога азотистого основания, проводя, таким образом, отбор против этих ревертантов, либо, в качестве альтернативного пути, периодически проверять, погибают ли миеломные клетки в среде ГАТ.

28.1.3. Слияние клеток разных, непрерывно растущих опухолевых линий

Для различных экспериментальных целей иногда бывает необходимо осуществить слияние В-клеток, принадлежащих двум клеточным линиям, одна (или обе) из которых не чувствительна к среде ГАТ. Для отбраковки несливших-ся клеток в этом случае обычно используют один из двух методов. Первый метод предполагает введение в предварительно выделенные ГГФРТ"-клетки маркера устойчивости к какому-либо другому агенту. Например, при слиянии клеток некоторых миеломных линий можно взять маркер устойчивости к уабаи-ну (ингибирующему (Na++K+)-ATPa3y). Если такие миеломные клетки слить с клетками другой линии в присутствии ГАТ и уабаина, выживут лишь гибриды, тогда как нормальные клетки погибнут [32]. Второй метод, описанный Райтом и Хайфликом [33] и использованный Барроузом и др. [34], заключается в обработке опухолевых клеток летальной концентрацией (2 мМ) иодацетамида непосредственно перед их слиянием с чувствительной к ГАТ миеломой. В этом случае будут выживать только опухолевые клетки, слившиеся с миеломой.

28.1.4. Выбор миеломы

Поскольку в гибридомах, получающихся после слияния клеток, продолжается синтез и секреция легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов сливающихся партнеров, появляется возможность образования «смешанных» гибридных молекул. За счет таких молекул может уменьшаться титр специфических антител и(или) могут возникать антитела с новой специфичностью, образующейся в результате гетерологичной комбинации цепей. Этого можно избежать, если для слияния использовать миелому, утратившую способность синтезировать свои собственные иммуноглобулиновые цепи. В настоящее время имеется несколько таких миелом (табл. 28.2), которые успешно используются для создания антителообразующих гибридом, секретирующих чистые антитела, не содержащие иммуноглобулиновых цепей миеломных родителей.

На первом этапе клетки этой линии окрашивали с помощью антител, специфичных к поверхностным у1-цепям, после чего неокрашенные клетки были отобраны с помощью проточного цитофлуориметра (FACS — fluorescence-activated cell sorter) и клонированы. Клетки одного из полученных клонов, как было затем показано методом иммунофлуоресценции, не экспрессировали цитоплазматического ylt но содержали в цитоплазме х-цепи. На двух следующих этапах клонирования было проверено 200 клонов на наличие цитоплазматических х-цепей и из них отобран один клон P3x63Ag8.653, клетки которого не секретировали родительских ух- и х-цепей даже после слияния. Недавно были описаны генетические дефекты, ответственные за неспособность клеток синтезировать разные иммуноглобулины в этом и других подобных случаях [35]. Ныне очень многие исследователи стремятся использовать несекретирующие миеломы ввиду их неоспоримых преимуществ. К сожалению, несекретирующих и одновременно способных к слиянию миелом человеческого происхождения, необходимых для создания гибридом человек—человек (см. ниже), пока не существует.

28.1.5. Способы иммунизации

Для получения имеющих практическое значение антителосекретирующих гибридом используются лимфоидные клетки, выделенные из различных источников, например, из селезенки или лимфатических узлов. При использовании для первичной иммунизации большинства чужеродных белков, полисахаридов и т. д. применяют следующую схему иммунизации: обычно вводят внутрибрюшинно 1—100 мкг антигена, смешанного с равным объемом полного адъюванта Фрейнда (ПАФ). Затем с интервалом 2—3 недели проводят одну или более внутривенных инъекций данного антигена в физиологическом растворе. Через 1—2 дня после последней инъекции клетки селезенки выделяют и сливают с клетками выбранной миеломной линии. Более интенсивная и короткая схема иммунизации используется для получения гибридом из клеток лимфатических узлов. В этом случае мыши вводят подкожно в подушечки задних лап, паховые районы и в несколько точек вдоль позвоночника 10—300 мкг антигена в ПАФ. Через три дня процедуру повторяют, используя вместо ПАФ неполый адъювант Фрейнда, а затем с интервалом в 3-—4 дня делают еще четыре инъекции антигена в физиологическом растворе. Через день после последней инъекции регионарные лимфоузлы, дренирующие область подкожных инъекций, удаляют, суспендируют и далее проводят слияние как обычно. Данная схема иммунизации является модификацией процедуры получения обычных гетерогенных анти-идиотипических сывороток, описанной в работе Либермана и др. [36].

Иммунизация корпускулярными антигенами, например чужеродными клетками крови, бактериями, различными паразитами, опухолевыми клетками или клетками, инфицированными вирусами, может проводиться без ПАФ путем 3—4 внутрибрюшинных инъекций с интервалами в 2—3 недели. При последней инъекции 5-107 клеток вводят внутривенно, а спустя 1—2 дня получают клетки селезенки и проводят слияние.

Данные примеры приведены лишь в иллюстративных целях. В действительности же схемы иммунизации, применяемые разными исследователями, значительно варьируют и определяются в большой степени имеющимся количеством и типом антигена. Использование клеток лимфатических узлов обладает тем преимуществом, что образуется больше гибридов, продуцирующих IgG. Эти антитела имеют преимущества перед моноклональными IgM-антителами ввиду большей легкости их выделения и очистки.

Помимо приведенных схем иммунизации описаны методы иммунизации клеток грызунов in vitro [37]. При получении гибридом грызунов такая иммунизация может и не иметь преимуществ перед иммунизацией in vivo, так как предваряющая слияние антигенная стимуляция В-клеток в данном случае оказывается лишь дополнительным этапом. В то же время, поскольку при создании человеческих гибридом часто невозможно получить клетки от иммунизированных больных, можно надеяться, что проведение в этих случаях антигенной стимуляции in vitro повысит частоту слияния опухолевых клеток с В-клетками соответствующей специфичности [38, 39]. Д. Ф. Кирней

28.1.6. Схемы слияния клеток

Описанная ниже схема слияния (рис. 28.3) — одна из тех, которые успешно используются во многих лабораториях. Применение полиэтиленгликоля в качестве сливающего агента широко используется благодаря его эффективности, простоте приготовления и воспроизводимости результатов. Другие схемы

страница 82
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.04.2017)