Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

топлазмой, анализа хромосом и взаимоотношений вирус—хозяин.

Своим появлением гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, обязаны экспериментам, посвященным изучению экспрессии и регуляции активности иммуноглобулиновых генов в миеломных клетках. С помощью вируса Сендай удалось гибридизовать миеломные клетки крысы и мыши [13].

28. Гибридомы и моноклональные антитела Затем в двух лабораториях независимо осуществили слияние клеток мышиной миеломы разных линий [14, 15]. При проведении дальнейших опытов уже с использованием селективных сред был сделан ряд существенных наблюдений, касающихся экспрессии иммуноглобулинов и имеющих важное практическое значение для успешного получения моноклональных антител. Во-первых, оказалось, что в гибридных клетках, образующихся в результате слияния двух мие-лом, продуцирующих иммуноглобулины, продолжают эксперессироваться оба родительских набора иммуноглобулиновых легких и тяжелых цепей, которые, ассоциируясь случайным образом, формируют гибридные молекулы [16]. Далее Милынтейн и Кёлер показали, что никаких новых иммуноглобулиновых цепей в гибридных клетках не синтезируется, что указывает на стабильность образования lg, а также на независимый контроль экспрессии иммуноглобулиновых генов от обоих родителей [17, 18]. И наконец, было обнаружено, что если происходит слияние варианта миеломы, не экспрессирующего ни легкие, ни тяжелые иммуноглобулиновые цепи штамма дикого типа, с иммуноглобулинопро-дуцирующей линией, то непродуцирующие клетки не подавляют способность, клеток другой родительской линии продуцировать иммуноглобулины, но продолжают поддерживать синтез иммуноглобулинов продуцирующего родителя [19].

Описанные эксперименты приобрели еще большее значение, когда Кёлер и Милынтейн [20] осуществили слияние нормальных клеток селезенки мыши, иммунизированной бараньими эритроцитами, с культивируемыми клетками миеломы и показали, что некоторые из полученных гибридов секретируют антитела к иммунизирующему антигену. Такие гибридные клетки, как и любые клеточные линии, длительно росли in vitro и выделяли большие количества специфических гомогенных антител в культуральную среду или могли расти in vivo в виде трансплантируемых опухолей. В последнем случае антитела обнаруживались в сыворотке крови и асцитной жидкости.

В этой главе обсуждаются разнообразные теоретические и практические вопросы, связанные с получением гибридом. Всюду по возможности рассматривается лишь целесообразность тех или иных процедур и методологии, а не точные экспериментальные детали. Обширный список литературы позволит читателю легко найти подробное описание интересующего его метода. Глава заканчивается обсуждением некоторых примеров, иллюстрирующих различные возможности применения гибридомной технологии, что послужит своего рода путеводителем для читателя, желающего использовать этот метод.

28.1. Общие вопросы, касающиеся получения

гибридом

Иммунная система способна давать имунный ответ на почти неограниченное число различных антигенов. Многочисленные антигенные детерминанты (эпитопы) каждого простого или сложного антигена (иммуногена) активируют множество клонов, начинающих продуцировать антитела с разной специфичностью, аффинностью и авидностью. В природе почти никогда не наблюдается истинный моноклональный ответ на антигены, хотя в ряде случаев в процесс антителообразования вовлекаются, вероятно, очень немногие В-клеточные клоны [21—23]. Конечно, хорошо известны примеры продуцентов моноклональных антител — это миеломы и другие опухоли В-клеток. Однако, несмотря на то, что такие клетки служат бесценным источником некоторых антиген-спеД. Ф. Кирней

цифических моноклональных антител, на практике чрезвычайно трудно получить миелому с заданной антигенной специфичностью [2, 24].

В 1976 г. Кёлер и Милынтейн детально описали метод слияния клеток, секретирующих антитела какой-то одной специфичности, с клетками непрерывно растущей миеломы [20]. Клон клеток, содержащих гены иммуноглобулинов, принадлежавшие как антителообразующей клетке, так и миеломе, наследовал от обоих антителообразующих родителей генетический материал, определяющий специфичность данных антител, а от непрерывно растущей миеломы — способность к неограниченному росту.

Как показано на рис. 28.1, при иммунизации животного антигеном антитела, секретируемые множеством В-клеточных клонов, активированных различными эпитопами введенного антигена, появляются в виде гетерогенной

Овычная гетерогенная антисыворотна

Моноклональные антитела

Слияние с миеломой

'Атг

^Ат, /Сывортка

ft*

At, At*

\5f

Рис. 28.1. Сравнение обычной антисыворотки, полученной in vivo, с моноклинальными антителами, полученными in vitro. Клонирование гибридом В-клеточного происхождения дает возможность выделять в неограниченном количестве антитела, иро-

В-клеткаЗ-

- — Клон 1

- - Клон 2-

КлонЗ —Н

дуцируемые индивидуальными клонами. Поскольку моноклональные антитела моноспецифичны, с их помощью можно изучать как отдельные антигены, так и отдельные эшттопы одного антигена. Ат — антитело, Аг — антиген, Эп-эпитон.

смеси в иммунной сыворотке. Путем получения гибридом из клеток каждого эпитоп-специфического клона с последующим клонированием гибридов возможно разделить моноклональные антитела, специфичные к одним и тем же или разным эпитопам одного антигена. Таким образом удается получить набор моноклональных антител против различных эпитопов определенной молекулы, или иммуногена. Такие высокоспецифичные антитела могут быть использованы для исследования структуры и функции разных частей молекул, а также тех или иных типов клеток без предварительной иммуноадсорбции. Другое важное преимущество сводится к возможности наработки фактически неограниченного количества антител, обладающих не меняющимися со временем специфичностью и аффинностью.

Из рассмотренных в гл. 10 и 12 физиологических аспектов активации В-клеток вытекает целый ряд соображений о механизме формирования гибридом. Поскольку частота встречаемости антителообразующих клеток в иммунной селезенке низка [10_3—10~5), необходимо во всех случаях стараться максимально увеличивать число антиген-специфических В-клеток, способных к

28. Гибридомы и моноклональные антитела 251

слиянию и образованию нормальных гибридов. Очевидно, что максимум синтеза антител (определяемых в сыворотке или путем подсчета бляшкообразующих клеток) не совпадает с максимумом образования специфических гибридов. Поэтому особо важное значение приобретает подбор условий иммунизации и установление в рамках выбранных условий оптимального времени слияния. По-видимому, под влиянием полиэтиленгликоля (ПЭГ) предпочтительно сливаются пролиферирующие или активированные с помощью антигена В-клетки. Подробно данный вопрос обсуждается в работе Паслея и Рузена [25]. Исходя из этого, следует использовать такую схему иммунизации, при которой слиянию подвергаются антиген-специфические клетки на той стадии дифференцировки, когда они пролиферируют или находятся в активированном состоянии (гл. 12).

Способы иммунизации, используемые при получении гибридом, как правило, так сильно варьируют, что наиболее целесообразно предоставить читателю возможность самому ознакомиться с соответствующей литературой, где он, по-видимому, всегда найдет подходящее для себя описание условий иммунизации, проводившейся с помощью какого-либо похожего антигена [26—29].

Идентификация клеток, продуцирующих антитела заданной специфичности,— это, пожалуй, самая важная процедура во всей гибридомной технологии. Поскольку новообразованные гибридомы могут быть нестабильны в отношении синтеза антител, желательно, чтобы методы раннего выявления отдельных антителообразующих клонов были быстрыми и простыми. Концентрация антител в лунках, содержащих гибридные клетки, обычно достаточно высока (10—100 мкг/мл). Поэтому чувствительность применяемых методов лимитируется, как правило, доступностью антигена. В настоящее время наиболее широкое распространение получили методы, основанные на реакции антиген—антитело,— радиоиммунологический анализ и(или) иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA) [26-31].

Обнаруженные антителообразующие клоны должны быть немедленно ре-клонированы. Необходимость быстрого реклонирования связана с тем, что после слияния во многих гибридах начинается «выброс» хромосом, продолжающийся до тех пор, пока число хромосом в клетке не станет равным приблизительно 2N. В ходе этого процесса некоторые клетки могут потерять хромосомы, несущие гены иммуноглобулинов. Существует опасность, что такие клетки, неспособные больше продуцировать иммуноглобулины, будут расти лучше антителообразующих клеток клона. В зависимости от плотности посева клеток после гибридизации в каждую лунку может попасть более одного гибридного клона. В этом случае возникает необходимость отделить ненужные антителообразующие клоны от тех, которые представляют интерес для исследователя.

28.1.1. Гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ). Обмен и процедуры отбора

При использовании современных методов гибридизации частота слияния между клетками двух популяций оказывается относительно низкой (~ 1/104) лимфоидных клеток). Поэтому чтобы отделить гибриды от опухолевых клеток миеломы или лимфомы (они служат партнерами при получении В- и Т-гибридом соответственно), нужно убить неслившиеся клетки, которые составляют большинство и которые в силу своей способности к быстрому и неограниченному росту in vitro будут неизбежно подавлять рост гибридных клеток. Обычно для этой цели применяется разработанный Литтлфилдом метод, основанный на предварительном выведении мутантных клеточных линий, дефектных по некоторым ферментам, участвующим в синтезе нуклеотидов [8]. В клетках млеД. Ф. Мирней

копитающих существуют запасные пути повторного включения предшественников пуринов и пиридинов в синтез ДНК и РНК (рис. 28.2). Выделение мутантов, не способных к синтезу ферментов, ответственных за эту реинкорпорацию, осуществляется воздействием мутагенов на клетки

страница 81
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(17.10.2017)