Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

ски, А. Дж. Берковер

Однако существует еще один эффект, также приводящий к увеличению наблюдаемой аффинности в двухфазной системе и имеющий место даже в слу- _ чае моновалентных антител (Fab-фрагментов) или моновалентных лигандов. Этот эффект связан с тем, что на поверхности локальная эффективная концентрация связывающих участков оказывается во много раз выше концентрации такого же числа участков, распределенных по всему объему раствора [31]. Иными словами, данный эффект обусловлен тем, что на границе твердого тела и жидкости нарушается высказанное при обсуждении константы ассоциации Касе предположение, что реагенты распределены по всему объему случайно (до некоторой степени это учитывалось, когда мы говорили об увеличении аффинности поливалентных реагентов). Данная ситуация была проанализирована в работах ДеЛизи[32], а также ДеЛизи и Вигеля [33], которые разбили реак-цию на два этапа — диффузионный процесс, необходимый для того, чтобы сблизить реагенты на требуемое расстояние и установить в правильной ориентации, и собственно реакцию. Комплекс антиген-антитело, в котором реагенты находятся в соответствующем положении, но еще друг с другом не реагируют, называется ориентированным комплексом. Тогда можно записать реакцию

S + D i+S... D % SD, (33)

где S — это связывающий участок антитела, D — антигенная детерминанта, к+ и к_ — константы скорости прямой и обратной диффузии, a kt и — константы скорости прямой и обратной реакций в том случае, когда ориентированный комплекс уже образован. Если концентрация ориентированных комплексов не меняется со временем, то полные константы скорости будут задаваться уравнениями

kt = klk+/(ki + k_), (34)

*, = *_!*_/(*! + *_), (35)

где индексы f и г относятся к прямой (forward) и обратной (reverse) реакциям [32]. Константа ассоциации, согласно уравнению (7), представляет собой отношение этих двух констант, т.е.

КйСС = к^к+1к^к_. (36)

Соотношение между величинами kt и к_ определяет предположительную судьбу ориентированного комплекса, показывая, какой процесс более вероятен — реакция с образованием SD или же распад комплекса на свободно диффундирующие Реагенты.

Предположим, что к_ мала по сравнению с Тогда связанный комплекс SD и ориентированный комплекс S .... D могут много раз превращаться друг в друга, до того как ориентированный комплекс распадется и один из реагентов перейдет в раствор. Если на поверхности имеется много антигенных детерминант D, то даже для моновалентного антигена (Fab) в случае диссоциации SD до S ... D может оказаться значительно легче вновь вступить в реакцию с той же самой или соседней детерминантой, чем перейти в раствор (возможность этого опять-таки определяется относительными величинами констант скорости /с4 и к2). Именно в большей вероятности снова вступить в реакцию с поверхностью, чем перейти в раствор, и заключается описываемый эффект. Более подробное математическое описание реакций на поверхности клеток дано у ДеЛизи [32], а также у ДеЛизи и Вигеля [33].

Несколько отличный от предыдущего, но представляющий значительный интерес анализ того же самого или очень похожего явления провели Силхеви и др. [34]. Эти авторы изучали случай диффузии лиганда из диализного мешка, содержащего белок, к которому лиганд имеет значительное сродство. Когда концентрация лиганда становится настолько низкой, что свободные участки связывания на поверхности белка оказываются в избытке, то скорость выхода лиганда из диализного мешка перестает быть просто скоростью диффузии или просто скоростью диссоциации комплексов белок—лиганд. Авторы показывают, что в данных условиях выход лиганда представляет собой реакцию квазипервого порядка, хотя время полужизни при этом оказывается в (1 -\- [Р] Касс) раз больше, чем в отсутствие белка:

*+ = Ul+[P]tfaeo), (37)

где [Р] — это концентрация лигандсвязывающих участков, Касс — аффинность, a t+ и t_ — время полужизни в присутствии и в отсутствие белка в диализном мешке соответственно.

В описанном случае белок находился в растворе, так что авторы могли использовать действительную концентрацию белка и действительную истинную аффинность Касс. Если же белок находится на какой-нибудь двухмерной поверхности, то вопрос о том, что считать эффективной концентрацией, становится сложнее. Однако можно принять, что высокая локальная концентрация белка, заключенного в диализном мешке, аналогична высокой локальной концентрации белка, присоединенного к твердому носителю. Поскольку в основе обоих явлений лежит по существу один и тот же механизм, можно предположить существование сходных эффектов. Например, в случае диализа присутствие в умеренной концентрации 10 мкм антител с аффинностью 108 М-1 может уменьшать скорость выхода лиганда в тысячу раз. В результате диализ, который в противном случае занимал бы трь. часа, теперь будет идти четыре месяца! Легко понять, что из за такого «задерживающего эффекта» даже не очень высокие значения аффинности будут казаться бесконечными, а реакции будут производить впечатление необратимых. Данный задерживающий эффект возникает не только в иммунологических, но и в других системах — например на клеточной поверхности или между клеточными компартментами, где локальная концентрация белка может быть высокой.

В заключение необходимо подчеркнуть следующее: поскольку описанные эффекты задержки зависят от наличия большого количества незанятых участков связывания, добавление значительного избытка немеченого лиганда для насыщения этих участков будет приводить к уменьшению или исчезновению эффекта задержки и к существенному ускорению диссоциации или выхода меченого лиганда. Такое действие немеченого лиганда может быть использовано в качестве теста на наличие задержки, хотя необходимо иметь в виду, что в определенных случаях тот же самый эффект может служить указанием на наличие отрицательной кооперативное™ между различными лигандсвязы-вающими участками.

23.3. Радиошшунологический анализ (РИА) и родственные ему методы

Радиоиммунологический анализ (РИА) впервые описали Ялоу и Берсон в 1960 г. [37]. Ныне РИА — наиболее чувствительный и весьма широко используемый метод определения концентрации различных биологических молекул. Основные принципы, необходимые для понимания и применения этого метода, Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер

уже были изложены в первых разделах данной главы. В настоящем разделе мы обсудим важнейшие идеи и методологические подходы, используемые в РИА. Для более детального изучения РИА читатель отсылается к книге Чарда [36] и обзорам Родбарда [37] и Ялоу [38].

Основная идея РИА заключается в том, что связывание высокорадиоак-тивномеченного антигена, взятого в бесконечно малой концентрации, со специфическими антителами, обладающими по отношению к нему значительной аффинностью и присутствующий в малой концентрации, оказывается очень чувствительным к конкуренции со стороны немеченого антигена и весьма специфичным к антигену. Вследствие этого концентрацию антигена в неизвестном образце можно определять по его способности конкурировать с меченым антигеном за связывание с антителами. Метод может быть использован для измерения низких концентраций молекул, даже в тех случаях, когда в исследуемой биологической жидкости имеются многочисленные примеси. Для этого необходимо приготовить радиоактивно меченный антиген и антитела, обладающие по отношению к нему высокой аффинностью, научиться отличать связанный меченый антиген от свободного, найти оптимальные для получения максимальной чувствительности концентрации антител и меченого антигена и, зная концентрации конкурирующего немеченого антигена, построить стандартную кривую, с помощью которой затем определить концентрацию антигена в неизвестных образцах. Кроме того, необходимо выбрать наиболее удобный способ графического (или численного) представления данных. Здесь мы не будем излагать методы приготовления антител и меченых антигенов, а обсудим другие этапы, а также наиболее сложные вопросы, касающиеся использования РИА.

23.3.1. Разделение связанного и свободного антигенов

Какой бы параметр мы не использовали для количественного описания конкуренции немеченого антигена с меченым, он всегда будет функцией концентрации связанного, или концентраций связанного и свободного радиоак-тивномеченного антигена. Поэтому одно из наиболее жестких методических требований заключается в том, чтобы уметь отличать связанную с антителом радиоактивномеченную молекулу антигена от свободной. Это обычно предполагает физическое разделение связанной и свободной метки и независимое измерение радиоактивности в обеих фракциях. Если фракция связанного лиганда загрязнена свободным лигандом, или наоборот, то в результате может получиться очень большая ошибка, величина которой будет зависеть от того, какой части стандартной кривой соответствуют условия эксперимента.

23.3.1.1. Методы разделения в растворе

Проведение РИА в растворе имеет то преимущество, что связывание в этом случае определяется истинной аффинностью антител. Однако при этом связанный и свободный антигены должны быть разделены способом, который не нарушает равновесия. Подходы, используемые для этого, относятся к трем основным типам: осаждение антител со связанным антигеном, когда свободный антиген остается в растворе, осаждение свободного антигена, когда в растворе остаются антитела и связанный антиген, и, наконец, разделение свободных и связанных с антителами молекул антигена в растворе по размеру с помощью гель-фильтрации. Последний способ слишком трудоемок, чтобы его можно было использовать, когда необходимо исследовать большое количество образцов. К тому же

23. Взаимодействие антиген—антитело он оказывается настолько медленным, что в ходе эксперимента равновесие может нарушиться. В связи с этим колоночная гель-фильтрация в РИА почти не применяется.

По-видимому, наиболее широко используются методы, в которых осаждаются антитела. Если антиген значительно меньше, чем антитело (мол. масса <30 кДа), то с помощью сульфата аммония [39] или полиэтиленгликоля с мо

страница 7
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(29.05.2017)