Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

ют среднюю аффинность и оценивают степень ее гетерогенности. Однако выяснить на основе этого графика точное количество субпопуляций с различной аффинностью, по-видимому, невозможно.

Предположим, что имеется m субпопуляций, каждая из которых присутствует в концентрации [SJ и характеризуется аффинностью Кх. Обозначая концентрацию свободного лиганда через [L], получим уравнение для концентрации комплексов каждого типа антител с лигандом, аналогичное уравнению (3'):

На основе графика Скэтчарда можно получить два различных средних (average) значения аффинности [18]. Величину К01 которая более употребительна, строго говоря, следует называть срединной (median), а не усредненной (mean) аффинностью. Эта величина определяется как наклон касательной^

23. Взаимодействие антиген—антитело проведенной через точку кривой, в которой половина связывающих участков оказывается занятой (рис. 23.5). Второе значение средней аффинности, которое мы будем обозначать как Кср, представляет собой взвешенное усредненное (mean) значение аффинностей, полученное взвешиванием каждой аффинности по относительной доле данной субпопуляции в суммарной популяции антител. Это можно записать в виде выражения

*ep=S *i[S,],/[S]t. (15) i=i

Из уравнений (13) и (14) очевидно, что Кср — это отношение двух отрезков, отсекаемых кривой Скэтчарда на осях B/F и В соответственно, т.е. попросту наклон изображенной на рис. 23.5 хорды. В связи с этим значение усредненного сродства Кср в некоторых случаях получить графически значительно легче, чем К0. В дальнейшем мы увидим, что Кср оказывается полезной и в графиках других типов.

23.2.1.4. Показатели гетерогенности: график Сипса

Для гетерогенной антисыворотки, кроме того, представляет интерес оценка степени гетерогенности по аффинности. Например, если бы аффинность имела нормальное (гауссово) распределение, интересно было знать дисперсию этого распределения [19, 20]. Были разработаны и более сложные способы анализа, не требующие особых предположений относительно формы распределения [21—23]. Однако определение наиболее часто встречающегося и хронологически появившегося раньше других показателя гетерогенности связано с произвольным предположением о том, что распределение аффинности соответствует нормальному распределению, впервые описанному Сипсом [24]. Приложение данного подхода к гетерогенным антителам разработали Низонофф и Прессмен [25], а в общем виде изложили Каруш и Каруш [26]. При использовании этого подхода предполагается справедливость уравнения

.___п(Кйс)«

которое аналогично уравнениям (3') и (11) (изотерма адсорбции Ленгмюра), за исключением наличия показателя степени а, характеризующего степень гетерогенности. Этот показатель изменяется от 0 до 1. При а = 1 уравнение (16) эквивалентно уравнению (3) и гетерогенность отсутствует. По мере того, как а убывает до 0, гетерогенность возрастает. Для получения величины а графическим способом необходимо преобразовать уравнение (16) следующим образом:

log[-^I7)^alogc + alogK0. (17)

Очевидно, что наклон графика зависимости log от с Равен показа-

телю гетерогенности а.

Ч. Де Лизи (личное сообщение) установил, как выражается дисперсия (второй момент) относительно среднего значения распределения Сипса через свободную энергию RT In К0. Результаты показывают, что разброс (или ширина распределения), нормированный на RT, зависит от а следующим обДж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер

разом:

gCnnca я2 (1 — а2) .. „

R2T2 ~~ За2 • ^ а>

Это выражение полезно для определения величины oCuncai которая может рассматриваться как аналогичное стандартному отклонению гауссового распределения, если при этом иметь в виду, что данное распределение не является истинно гауссовым. Кроме того, как отмечалось выше, использование распределения Сипса предполагает, что распределение аффинности (на самом деле значений свободной энергии) является непрерывным, симметричным относительно усредненного (mean) и может быть аппроксимировано гауссовым распределением. Это предположение часто не выполняется.

23.2.1.5. График зависимости B/F от F или Т

В другом методе, используемом для оценки степени гетерогенности аффинности, строится график зависимости отношения концентрации связанного

Если по оси авсцисс отложено И* . 1_

F илиТ (логарифмический масштаб)

Рис. 23.6. График зависимости отношения концентраций связанного и свободного антигена (К), от концентрации свободного (F) антигена или общей (Т) концентрации антигена. Кривые имеют аналогичную S-образ-ную форму, однако, если положение срединной точки (в которой R = R0/2) графика

зависимости R от Т определяется концентрацией связывающих участков антител [S]t, то срединная точка графика зависимости R от F в точности соответствует F = \1 К и не зависит от концентрации антител (по [18]; с изменениями).

(В) и свободного (F) лиганда от концентрации свободного (F) лиганда или общей (Т) концентрации лиганда [18] (рис. 23.6). Для удобства обозначим отношение B/F через R, a R0 определим как предельное значение R, при F 0 (т.е. как длину отрезка, отсекаемого графиком на оси B/F). Вначале, в случае гомогенной популяции антител, из уравнения (3') получаем

Определим срединную точку графика (рис. 23.6) как точку, в которой R равняется половине начальной величины, R0, т.е. где R — К [S]t/2. В случае гомогенных антител (т.е. имеющих одинаковую аффинность), подставив K[S]t/2 (т.е. R0J2) вместо B/F в уравнение (8) [18], для срединной точки

23. Взаимодействие антиген—антитело (21)

И

B = [S]f/2,

поэтому общая концентрация лиганда Т равняется:

(22)

T = B+F = i^- + 4--

(23)

Таким образом, если мы построим график зависимости B/F от F, то по положению срединной точки прямо получим величину ПК. Однако для экспериментатора часто более удобным оказывается построение графика зависимости B/F от Т. В этом случае срединная точка уже не соответствует величине, обратной аффинности. Как видно из уравнения (23), предположение о том, что срединная точка соответствует ПК, приведет к ошибке, равной половине концентрации антителосвязывающих участков. Таким образом, используя зависимость B/F от Т, по положению срединной точки можно довольно точно оценить величину сродства, если [S]t/2Для гетерогенной антисыворотки, как уже было показано,

т.е. при этом оказывается возможным получить еще п значения средней аффинности (определение этой величины дано выше [18]).

Даже если гетерогенность не изменяет средней аффинности, она вызывает уширение кривой или уменьшение ее наклона. Это можно понять, если представить кривую зависимости B/F от F в виде ступенчатой функции. Каждая субпопуляция антител с данной аффинностью К1 будет титроваться до 50% своего микроскопического значения B/F при концентрации свободного лиганда F = HKt Антитела с высокой аффинностью будут титроваться при низких значениях F, а с низкой аффинностью — при более высоких значениях F. Результирующая ступенчатая функция аналогична последовательным переходам, соответствующим различным значениям рК при рН-титровании.

Обсуждавшаяся до сих пор аффинность Касс — это как раз та величина, которая была названа истинной аффинностью, т.е. аффинностью каждого взятого в отдельности антигенсвязывающего центра антитела. Введение дан-

1 Важно отметить, что R0 должно быть предельным значением B/F, когда F действительно приближается к нулю. В методе РИА, в котором используемые концентрации метки существенны по сравнению с 1/К, даже уменьшение концентрации немеченного лиганда до нуля не приведет к истинному предельному значению R0, поскольку для определения R0 концентрация метки также должна быть пренебрежимо малой. Если же это не так, то полученные значения величин R0, а следовательно, и К, окажутся заниженными.

(13)

Следовательно, в срединной точке, т.е. когда B/F = RJ2, будет

^ср- ( р ) (-[Slf ) - [8]°

(24)

23.2.1.6. Истинная аффинность ной величины в наши уравнения допустимо безотносительно к валентности антител, если при этом используется концентрация антигенсвязывающих центров [S], а не концентрация молекул антител [А], способных . иметь более одного участка связывания. Даже в отсутствие кооперативное™ между анти-генсвязывающими центрами возникает статистический эффект, приводящий к тому, что функциональная аффинность отличается от истинной, если антитела поливалентны и используется концентрация молекул антител, а не связывающих участков. Возникновение этого различия может быть лучше всего проиллюстрировано на примере бивалентных антител, таких как IgG. Мы предполагаем, что оба участка связывания в молекуле IgG эквивалентны и не оказывают влияния друг на друга. Лиганды, как и везде в данном разделе, предполагаются моновалентными. Связывание лиганда при этом происходит в два этапа:

К к A + L^AL, AL-f- L =f* AL2, (25)

каждому из которых соответствует определенное значение функциональной аффинности:

1_ [A][L] ' A*-[AL][L]* ^ '

Если истинная аффинность обоих эквивалентных участков равна К, то когда самая первая молекула только собирается связаться на этапе 1, Kt будет в действительности в два раза больше Кг, поскольку концентрация доступных при этом участков [S] будет в два раза больше концентрации антител. Однако если один участок связан, то обратная реакция этапа 1, может идти только в одном участке — именно в том, который занят. Наоборот, на втором этапе для прямой реакции имеется лишь один оставшийся свободным участок, тогда как в случае обратной реакции AL2 AL -f- L для возврата в AL-coc-тояние диссоциация может идти в любом из связывающих центров. Занятый второй участок совсем не обязательно должен освободиться первым, а поскольку центры связывания идентичны, ни о каком различии между ними при диссоциац

страница 5
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.09.2017)