Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

ссмотрим здесь два. По-видимому, наиболее широко используется способ, описанный Скэтчардом [12] (рис. 23.3). Закон дейст-

Рис. 23.3. Графики Скэтчарда, описывающие связывание меченного 3Н миоглобина кашалота с моноклональными антителами к миоглобину (Л) и с сывороточными антителами, выделенными из той же мыши, клетки селезенки которой использовались для получения гибридомы (Б). Для моноклональных антител (клон HAL 43-201Е11, клон 5) график Скэтчарда представляет собой прямую с наклоном 1,6-10* М-1, чис-

ленно равным —J^acc- Отрезок, отсекаемый этой прямой на оси абсцисс, равняется концентрации связывающих участков антител. Для сывороточных антител (в отличие от моноклональных) график Скэтчарда представляет собой вогнутую вниз кривую, что свидетельствует о гетерогенности антител по аффинности ([13]; печатается с разрешения).

вующих масс для условия равновесия, как уже указывалось, записывается в форме уравнения (3): I

[SL] = tfacc([S]t-[SL])[L], (3)

Заменив [SL] и [L], обозначающие концентрацию связанного и свободного лиганда, соответственно на В hF, получим уравнение Скэтчарда:

4=^acc(lSb-B). (8)

Заметим, что при таком, на первый взгляд, очень простом преобразовании было сделано одно весьма существенное предположение. Величина [SL] в уравнении (3) обозначает концентрацию насыщенных участков связывания антител, так что ([S]t — [SL])= свободные [S]. В уравнении (8) эта же величина обозначается буквой В. Если лиганд ведет себя как моновалентный, то такая замена законна, поскольку каждой связанной молекуле лиганда соответствует насыщенный участок связывания на антителе. Но если лиганд поливалентен

23. Взаимодействие антиген—антитело и может связываться более чем с одним участком антитела, то уравнение (8) остается справедливым только при условии избытка лиганда, когда вероятность связывания данной молекулы лиганда более чем с одним участком на антителе оказывается весьма малой. В данной части мы будем рассматривать лишь моновалентные лиганды, однако в других случаях при проведении анализа Скэтчарда это замечание необходимо иметь в виду.

Из уравнения (8) видно, что график зависимости величины B/F от В должен представлять собой прямую (если все антитела имеют одинаковое сродство) с наклоном Кясс, отсекающую на оси абсцисс отрезок, численно равный концентрации связывающих участков антител (рис. 23.3). Это так называемый график Скэтчарда. Используется и другой вариант графика, нормированный на концентрацию антител, который особенно удобен в тех случаях, когда данные были получены при различных общих концентрациях антител [А],, а не при постоянной [A]t. Однако для построения этого варианта графика требуется независимое измерение общей концентрации антител, не связанное с измерением длины отрезка, отсекаемого на оси абсцисс. Разделив тогда уравнение (8) на общую концентрацию молекул антител (безотносительно к тому, сколько участков связывания приходится на одну молекулу), получим

-?- = tfacc(ii-r), (9)

где г — количество насыщенных участков, приходящееся на одну молекулу антитела, п — общее количество участков, приходящихся на одну молекулу антитела, ас — концентрация свободного лиганда (с = F), т.е. г = B/[A]t, п — [S]t/[A]t, где [A]t — общая концентрация антител в молях. В данном варианте графика Скэтчарда (зависимость г/с от г) наклон прямой также равняет ся —Касс, а на оси абсцисс отсекается отрезок, равный п. В результате можно определить количество участков связывания, приходящееся на одну молекулу. Конечно, если [S]t определяется через длину отрезка, отсекаемого на оси абсцисс графиком зависимости от В [см. уравнение (8)], то тогда, разделив [S]t на измеренную любым независимым способом концентрацию антител, можно также определить и количество участков связывания, приходящееся на одну молекулу. Поэтому единственное преимущество предварительной нормировки всех экспериментальных точек и построения r/c-варианта графика проявляется в том случае, когда данные бывают получены при различных концентрациях антител. Если же концентрация антител неизвестна, но остается постоянной, то B/F-форма графика более удобна, так как показывает собственно концентрацию антител (участков связывания лиганда). Поскольку теперь мы знаем значение п для каждого класса антител (2 для IgG и сывороточных IgA, 10 для IgM), то во многих случаях концентрацию антител легко можно перевести в концентрацию участков связывания лиганда и обратно.

23.2.1.2. Гетерогенность по аффинности к антигену

Следующий уровень сложности возникает тогда, когда применяют смесь антител, обладающих различным сродством к данному лиганду. Как правило, используют антитела из иммунной сыворотки. В некоторых случаях антитела разделяют таким образом, чтобы они оказались специфичными к одному и тому же участку антигена, т.е. были моноспецифичными. На рис. 23.3 представлены графики Скэтчарда для антител к миоглобину. График Скэтчарда для моноклональных антител к миоглобину представляет собой прямую линию (рис. 23.3, А), тогда как аналогичный график для сывороточных антиДж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер

тел из той же самой! мыши, которая была использована для получения гибридомных моноклональных антител имеет вид изогнутой кривой (рис. 23.3,Б). Такой характер графика Скэтчарда типичен для смеси антител, гетерогенных по аффинности. В некоторых системах, как, например, в системе гормон-рецептор, где между участками связывания на рецепторе возможна отрицательная кооперативность (т.е. когда связывание гормона с одним участком

Рис. 23.4. График Скэтчарда, построенный для реакции антигена со смесью двух субпопуляций антител с различной аффинностью. Антитела обладают аффинностью, равной K-l и К2 и имеют соответственно гех и ге2 участков связывания на одной молекуле, г — концентрация связанного антигена, разделенная на полную концентрацию антител (т. е. количество связанных участков, приходящееся на одну молекулу), а с — концентрация свободного антигена. Кривая представляет собой гиперболу, в которой можно выделить две асимптоты, соответствующие линейным графикам Скэтчарда

отдельных компонентов смеси антител. Касательные к кривой, построенные в точках пересечения кривой с осями координат, лишь приблизительно соответствуют этим асимптотам, так что из наклонов касательных можно получить лишь оценочные, но не точные значения аффинности антител каждой из субпопуляций. Однако отрезок, отсекаемый кривой на оси абсцисс, равен пх + ге2. Заметим, что в данном случае п1 и п2 должны быть выражены через полную концентрацию антител, а не через концентрацию каждого компонента.

снижает сродство к гормону других участков молекулы рецептора), нелинейность графика Скэтчарда может быть вызвана отрицательной кооператив-ностью при отсутствии какой-либо истинной гетерогенности по сродству. Однако в случае антител (для которых было продемонстрировано отсутствие аллостерических эффектов) вогнутость графика Скэтчарда свидетельствует о наличии гетерогенности по сродству.

Можно было бы предположить, что тангенсы наклона кривой в разных точках численно равны аффинности разных субпопуляций антител. Хотя математически это не совсем корректно, тем не менее более крутая часть кривой соответствует антителам с более высокой аффинностью, а сравнительно пологая — антителам с относительно низкой аффинностью. Для более точного количественного анализа слагаемых таких кривых были предложены графические методы [14, 15], а также написанная Мансоном и Родбардом [16] компьютерная программа «LIGAND», обладающая широкими возможностями и легко изменяемая. Это позволило использовать такие кривые для характе-

23. Взаимодействие антиген—антитело ристики смеси некоторого количества субпопуляций антител, различающихся по аффинности. В данной главе мы разберем лишь случай двух субпопуляций антител с разной аффинностью, а затем рассмотрим методы расчета средней аффинности, предложенные для тех случаев, когда имеет место значительно большая гетерогенность. Кроме того, будет дана математическая оценка степени гетерогенности (аналогичная оценке дисперсии распределения).

Если популяция антител состоит только из двух субпопуляций с различной аффинностью, равной соответственно Kt и /С2, то мы можем добавить в уравнение (3') еще один член и получить

так что

г ntKi . пгК2

с l + KlC ^ 1 + К2

(10')

где индексы соответствуют двум различным субпопуляциям. В этом случае график зависимости г/с от г окажется гиперболой, асимптоты которой фактически будут представлять собой линейные графики Скэтчарда обоих компонент (рис. 23.4). Данный случай проанализировал графически Брайт [17]. Нетрудно показать, что при с —»- 0 и c-voo отрезок, отсекаемый кривой от оси абсцисс, равен щ + пъ (или в случае графика зависимости B/F от В — общей концентрации связывающих участков [S]t), а на оси ординат — niKi + п2К2. Таким образом, измеряя длину отрезка, отсекаемого кривой от оси абсцисс, можно определить суммарную величину п (или [S]t). Проблема заключается в нахождении аффинности обеих субпопуляций Kt и К1Т а также концентраций каждой из них (соответствующих п1 и п2). Если Ki ^> К2, то аффинность для каждой из популяций можно определить, исходя из наклона касательных к кривой, проведенных в точках пересечения кривой с осями координат (рис. 23.4), однако эти касательные в общем случае не будут точно параллельны двум асимптотам, дающим истинные значения аффинности, так что при определении К j и К2 таким способом вносится ошибка, зависящая от относительных значений ni и ге2, а также Ki и К2. Графический метод точного определения сродства разработал Брайт [17], а компьютерные методы — Мансон и Родбард [16].

23.2.1.3. Средние значения аффинности

Конечно, на практике очень редко можно быть уверенным, что имеешь дело именно с двумя субпопуляциями, поскольку большинство антисывороток значительно более гетерогенно. Поэтому приведенный выше пример имеет скорее иллюстративное, чем практическое значение. Пользуясь нелинейным графиком Скэтчарда, обычно определя

страница 4
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(12.12.2017)