Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

т большее влияние на увеличение D, пропорционального l/ri + 1/г2

23. Взаимодействие антиген—антитело (в котором меньший радиус г4 дает больший член), чем на уменьшение а (в которое теперь больший вклад вносит радиус г2). Например, если, как и раньше, гг = г, а г, = 0,1 г, то числитель в уравнении (76) уменьшится с 4 г2 лишь до 1,21 г2, в то время как знаменатель сократится с 1 г2 до 0,1 г2. В результате отношение увеличится с 4 до 12,1. Другими словами, увеличение диффузионной подвижности небольшого гаптена перевешивает уменьшение размеров реагирующего участка в сравнении с таковым большего белкового антигена, поскольку все равно в реакции присутствует антитело, у которого площадь реагирующего участка достаточно велика.

Скорость диссоциации k_t зависит от прочности связей, определяющих высоту энергетического барьера активации диссоциации, и от энергии теплового движения кТ (где к — постоянная Больцмана), обеспечивающей преодоление этого барьера. Энергия активации диссоциации представляет собой разность энергий начального состояния и переходного высокоэнергетического состояния, в которое система должна перейти для того, чтобы диссоциация стала возможной.

Эйзен [7] указывает, что при сравнении способности связываться с антителом у ряда родственных антигенов, имеющих близкие размеры и сходные физические свойства, скорость ассоциации во всех случаях окажется очень близкой, а различия в аффинности в значительной степени будут определяться различием скоростей диссоциации.

Наглядным примером могут служить антитела к белковому антигену — стафилококковой нуклеазе [8]. Антитела к нативной нуклеазе фракционировали на колонках с различными фрагментами нуклеазы. В результате была получена фракция антител, специфических к участку, находящемуся между остатками 99 и 126. Константа ассоциации этих антител с нативным антигеном составляла 8,3-108 М-1, а константа скорости ассоциации коа = 4,1-Ю5 М-1 с-1. В полном соответствии с тем, что говорилось выше, значение коа оказалось на несколько порядков меньше величины, наблюдаемой для небольших гаптенов [9]. Подставив эти значения в уравнение (7), получили значение величины kott, равное 4,9-10~4 с-1. Зная kotv представляющую собой константу реакции первого порядка, можно определить время полужизни комплекса (поскольку ti/2 = In 2/kott), оказавшееся равным 23 мин. Подобные скорости, по-видимому, типичны для антител, обладающих высокой аффинностью К.лсс ~ 109М-1 по отношению к небольшим белковым антигенам, таким как нуклеаза (мол.масса ~ 17 ООО). Скорость диссоциации важно знать при постановке эксперимента, поскольку если само измерение нарушает равновесие, то время , в течение которого должно проводиться измерение (т.е. отличие связанного реагента от свободного), определяется временем полужизни комплекса. Например, если tl/2 = 23 мин, то двухминутная процедура, включающая разбавление смеси антиген-антитело, может быть завершена еще до того, как произойдет значительная диссоциация. Однако, если бы скорость прямой реакции осталась неизменной, а аффинность уменьшилась в 10 раз, оставаясь еще довольно значительной — 8-107 М--1, то за время , необходимое для проведения эксперимента, смогло бы диссоциировать 50% комплексов. Это соображение весьма существенно при обсуждении методов определения сродства и способов изучения кинетики связывания.

Поскольку при постановке эксперимента знание скорости диссоциации может оказаться весьма важным, необходимо сказать несколько слов о методах ее измерения. По-видимому, наиболее широко распространенный метод связан с использованием антигена, меченного радиоактивным изотопом. После того, как достигнуто состояние равновесия и определена равновесная конценДж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер

трация связанной радиоактивности, добавляется большой избыток немеченого антигена. Поскольку любая диссоциировавшая из комплекса радиоактивная молекула антигена быстро замещается немеченой молекулой, вероятность того, что радиоактивная молекула вновь войдет в состав комплекса, очень мала. Следовательно, для определения константы диссоциации комплекса можно измерять уменьшение концентрации связанной радиоактивности со временем1.

23.2. Аффинность

Из сказанного выше представляется очевидным, что существенная информация о реакции антиген-антитело заключена в одной единственной величине— аффинности. В этом разделе мы рассмотрим аффинность более подробно, обсудив в том числе методы измерения аффинности и определения гетерогенности молекул по сродству. Кроме того, мы выясним влияние на аффинность поливалентности антител и (или) антигена и проанализируем пространственные эффекты, наблюдающиеся в том случае, когда взаимодействие антиген-антитело происходит на твердой поверхности (в двухфазных системах).

j 23.2.1. Взаимодействие антител с моновалентным лигандом

в растворе

'Наиболее простой случай — это взаимодействие антител с моновалентным лигандом. Сюда мы можем отнести реакцию антигаптеновых антител с истинно моновалентными гаптенами, а также реакцию с макромолекулами специфических антител, фракционированных для получения популяции, взаимодействующей только с одним неповторяющимся участком на антигене2. В последнем случае антиген ведет себя как моновалентный лишь при взаимодействии со строго определенной популяцией антител. Замечание о том, что участок узнавания (антигенная детерминанта) не должен быть повторяющимся, т.е. может встречаться в каждой молекуле антигена лишь однажды, конечно же является принципиальным.

Если антигенсвязывающие центры, находящиеся на одной молекуле антитела, независимы (т.е. не обнаруживают при связывании антигена ни положительной, ни отрицательной кооперативности), то во многих случаях такие участки, реагирующие с моновалентными лигандами, ведут себя так, как если бы они представляли собой отдельные молекулы. Поэтому многие (но не все) свойства, которые мы будем обсуждать, можно анализировать на уровне концентрации связывающих участков антител независимо от количества таких участков, приходящихся на одну молекулу антитела (2 для IgG и IgA, 10 для IgM).

При определении аффинности какого-либо антитела обычно измеряют равновесные концентрации связанного и свободного лиганда при увеличивающей-

1 В данном методе предполагается, что все связывающие участки независимы. Для антител и моновалентных лигандов это предположение, как правило, справедливо. Если же при связывании имеет место отрицательная или положительная кооперативность, то диссоциация из комплекса одной радиоактивномеченной молекулы антигена будет приводить к изменению скорости диссоциации меченых молекул антигена, связанных с другими участками.

2 Такие фракционированные антитела могут представлять собой смесь антител, специфичных к перекрывающимся участкам в пределах какого-либо одного домена на антигене. Тем не менее если две молекулы антител (или два участка связывания одной молекулы антитела) не могут одновременно связываться с одной и той же молекулой антигена, то антиген эффективно будет вести себя как моновалентный.

23. Взаимодействие антиген—антитело ся общей концентрации лиганда и постоянной концентрации антител. Можно и и наоборот, варьировать концентрацию антител, но тогда анализ несколько усложняется. По-видимому, теоретически наиболее изящным методом определения равновесных концентраций является равновесный диализ [10, 11], схематически показанный на рис. 23.2. При равновесном диализе лиганд (антиген) распределяется между двумя отсеками, свободно проходя через разделяющую их полупроницаемую мембрану, непроницаемую для антител, находящихся лишь в одном из отсеков. Преимущество данного метода перед большинством других состоит в том, что концентрацию лиганда в каждом отсеке можно определять, не нарушая равновесия. Однако метод имеет тот недостаток,

Рис. 23.2. Равновесный диализ. Сосуд разделен на две камеры полупроницаемой мембраной, которая свободно пропускает лиганд и совсем не пропускает антитела. Антитела добавляются в одну камеру (Б), а лиганд — в какую-нибудь одну или в обе камеры. Независимо от того, как был распределен лиганд первоначально, через некоторый промежуток времени, достаточный для того, чтобы установилось равновесие, его распределение станет вполне закономерным. Концентрация свободного лиганда в обеих камерах окажется одинаковой и, кроме того, в отсеке Б будет находиться дополни-

тельное количество лиганда, связанного с антителами. Таким образом, концентрация связанного лиганда будет равна разности концентраций лиганда в камерах Б и А, а концентрация свободного лиганда—концентрации лиганда в камере А. Поскольку эти концентрации должны удовлетворять закону действующих масс [уравнение (2)), то, зная их, можно, пользуясь уравнением (3) или (3') и сделав некоторое графическое построение (например, построив описываемый в тексте график Скэтчарда), определить аффинность ЛГасс.

что он применим лишь для достаточно небольших по размеру антигенов, способных свободно проходить через непроницаемую для антител мембрану. Еще один технический недостаток метода заключается в том, что концентрация связанного антигена определяется как разность суммы концентраций связанного и свободного антигена в другом отсеке, а не измеряется независимо от свободного антигена.

В методах, относящихся к другой группе, используются радиоактивно-меченные лиганды, находящиеся в равновесии с антителами. В этих методах предусматривается физическое разделение свободного и связанного с антителами лиганда и независимый подсчет количества того и другого. Ряд методов, используемых для разделения свободного и связанного антигена, будет обсуждаться ниже в разделе, посвященном радиоиммунологическому анализу. Их применение обычно позволяет провести независимое измерение концентраций связанного и свободного антигена, но при этом может нарушаться равновесие. Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер

23.2.1.1. Анализ по Скэтчарду

Если данные уже получены, то существует много способов расчета аффинности, из которых мы ра

страница 3
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.11.2017)