Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

нку и подвергают электрофорезу, после чего проводят иммунодиффузию против антисыворотки к белкам человеческой сыворотки, к х- или Х-цепям иммуноглобулинов человека. Наблюдаемое на рисунке 23.22, Б уширение дуги преципитапии IgG у больных 1 и 2, судя по всему, обусловлено присутствием аномальных молекул IgG. Точно такой же электрофоретической подвижности соответствует у больного 1 линия преципитации с антителами к х-цепям, но не к л-цепям (у больного 2 — наоборот), что служит серьезным основанием для постановки диагноза миеломной или моноклональной гаммапатии, поскольку эти белки, как известно, являются продуктом единственного клона, синтезирующего легкие цепи только одного из двух типов. У человека в нормальных иммуноглобулинах имеются оба изотипа легких цепей, хотя содержание х цепи превышает содержание Х-цепи примерно в два раза. Как можно видеть на рис. 23.22,1? (больной 2), аномальная дуга с ^-подвижностью реагирует с анти-IgG- и анти-А,, но не с анти- х. Следовательно, она соответствует моноклональному белку IgG-A,. У больного 1, наоборот, ненормальный сывороточный компонент реагирует с анти-IgG и анти-х, но не с анти-А,, что говорит о присутствии миеломного белка IgG-x.

23.6.2.6. Ракетный электрофорез [121]

В ракетном электрофорезе, как и в описанном выше методе Манчини, на стеклянную поверхность наносят слой агарозного геля, содержащего специфические антитела, после чего в небольшие вырезанные в геле лунки добавляют антиген. Под действием электрического поля заряженные молекулы мигрируют в гель, тогда как молекулы антител, положение которых примерно соответствует их изоэлектрическим точкам, остаются неподвижными. В отличие от описанных выше методов диффузии в ракетном электрофорезе перемещение молекул антигена обусловливается не градиентом концентрации, а движущей силой, создаваемой электрическим полем. Поскольку при этом из стартовой лунки выходит весь образец, в опыте можно использовать более низкие концентрации антигена. При прохождении через гель молекулы антигена взаимодействуют с находящимися в нем специфическими антителами. Первоначально концентрация антигена столь велика, что между антигеном и антителами образуются лишь растворимые иммунные комплексы (антиген2—антитело и антиген—антитело). В результате движение связанных молекул антигена по сравнению с избыточными свободными молекулами оказывается замедленным. Когда свободный антиген проникает в зону, где его концентрация эквивалентна концентрации антител, начинает формироваться иммунный преципитат. Экспериментально было обнаружено, что граница области преципитации антиген—антитело по форме напоминает ракету (отсюда и название метода), ориентированную в направлении электрического поля и прямо пропорциональную по высоте начальной концентрации антигена [121].

Хотя интуитивно можно предположить, что площадь ракеты должна быть пропорциональна концентрации антигена, фактически же в центре ракеты к концу электрофореза обнаруживается лишь незначительное количество антигена. Для выяснения зависимости размеров ракеты от концентрации антигена необходимо рассмотреть условия, в которых происходит перемещение границы преципитации. По мере того как фронт распространения антигена движется вперед, количество молекул антигена в нем постепенно уменьшается. Это продолжается до тех пор, пока концентрация антигена на границе не становится эквивалентной концентрации антител в геле, после чего начинается преципи-

23. Взаимодействие антиген—антитело тация. Зона, следующая за фронтом антигена, содержит комплексы молекул антигена с антителами (антиген2—антитело и антиген—антитело). В этой зоне нет свободных молекул антигена, которые могли бы участвовать в дальнейшем продвижении переднего фронта. В то же время по мере того как комплексы антиген2—антитело оказываются внутри переднего фронта, они растворяют образовавшийся преципитат и перемещают границу преципитации вперед. Когда комплексы антиген2—антитело кончаются, остаются лишь комплексы антиген—антитело, которые не способны растворять преципитат, поскольку могут лишь пристраиваться к уже сформированной решетке. Начиная с этого момента высота ракеты уже больше не будет меняться. Площадь ракеты (и высота у ракет одинаковой ширины) должна быть пропорциональна отношению количества антигена (почти целиком находящегося теперь в составе экви-молярных комплексов антиген-антитело) к концентрации антител в геле (т.е. к количеству антител, приходящемуся на 1 см2). При электрофорезе положение границы преципитации не меняется, хотя по мере того, как комплексы антиген-антитело пристраиваются к решетке, интенсивность полосы увеличивается. Соотношение между высотой ракеты и отношением количества антигена к концентрации антител при этом также остается постоянным.

Существенное преимущество ракетного электрофореза заключается в том, что он позволяет получать количественные характеристики и является более чувствительным, чем метод Манчини. Поскольку высота ракеты пропорциональна концентрации антигена, количество антигена в неизвестном образце можно определить путем сравнения высоты экспериментально полученной ракеты с высотами нескольких стандартных ракет. При любой концентрации антигена высоту ракеты, а следовательно, и чувствительность метода можно увеличить путем уменьшения заданной концентрации антител в геле. В этом случае антиген сможет пройти большее расстояние, пока его концентрация не уменьшится до уровня эквивалентности. Как показывает практика, нижний предел для обнаружения большинства антигенов с помощью метода ракетного электрофореза составляет от 1 до 10 нг.

23.6.3. Гемагглютинации и ее торможение

23.6.3.1. Гемагглюгинация [122]

Гемагглютинации представляет собой один из наиболее чувствительных методов, с помощью которых можно получать полуколичественные характеристики взаимодействия антител с антигеном. Метод этот включает в себя агглютинацию с помощью антител эритроцитов, предварительно нагруженных антигеном [122]. Поскольку антиген в данном случае имеет не эндогенное происхождение, подобная реакция называется пассивной гемагглютинацией. На-тивные эритроциты несут на себе отрицательный заряд, что приводит к возникновению между ними электростатических сил отталкивания, препятствующих агглютинации. Однако после обработки танином (0,02 мг/мл в течение 10 мин при 37°С) клетки начинают легко слипаться друг с другом.

Необработанные эритроциты довольно просто покрыть легко адсорбирующимися антигенами полисахаридной природы. Что касается белковых антигенов, то адсорбция некоторых из них после обработки клеток танином идет хорошо, а клетки в результате становятся весьма чувствительными к антителам. В то же время связывание других белковых антигенов с эритроцитами оказывается довольно нестабильным. Именно в этом заключается причина ограниченного использования данного метода для определенных антигенов. ОчеДж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер

видно, что небольшие агрегаты и частично денатурированные белки будут адсорбироваться предпочтительно [122]. Чистота антигена на этапе адсорбции тоже оказывается чрезвычайно важной, поскольку возможные примеси могут конкурировать за связывающие участки на поверхности клеток. После обработки танином и адсорбции антигена эритроциты хранят в 1%-ном растворе

Рис. 23.23. Гемагглютинации нагруженных красные эритроциты еще способны покрыть антигеном эритроцитов с помощью специфи- дно лунки, равен 212 для образцов А и Б, ческих антител. Антисыворотку добавляют 2' — для образцов В и Г. Опыты Д и Е — в крайние левые лунки планшета и после- вто контроли, поставленные с сыворотками, довательно разбавляют слева направо, взятыми до иммунизации. У образцов А Нагруженные антигеном эритроциты до- и Б обнаруживается слабый прозонный бавляют в каждую лунку, после чего про- эффект в первой лунке. (Фото любезно исходит их осаждение. Титр, определяемый предоставлено D. L. Nelson и R. Yarchoan). как наибольшее разведение, при котором

сыворотки для предотвращения спонтанной агрегации. Если обработка танином не была проведена, то адсорбцию некоторых антигенов белковой природы можно облегчить путем обработки клеток хлоридом хрома, действие которого, по-видимому, заключается в нейтрализации отрицательных зарядов на клеточной поверхности. Наконец, с помощью бивалентных сшивающих агентов, таких как бисдиазобензидин или глутаровый альдегид, или с помощью карбо-диимида проводят ковалентное присоединение антигенов к поверхности клеток.

Проверку специфичности антител осуществляют путем последовательного разбавления антисыворотки в U-образных лунках многоячеечного планшета (рис. 23.23). Затем в каждую лунку добавляют по 0,1 мл 1 %-ной суспензии эритроцитов, нагруженных антигеном. После перемешивания происходит осаждение

23. Взаимодействие антиген—антитело клеток в течение двух часов. В присутствии специфических антител агглютинированные клетки оседают на круглое дно лунки, покрывая его ровным слоем. Неагглютинированные эритроциты скользят вниз по стенкам лунки и формируют на самом дне плотный осадок в виде точки. Титр образца определяют по самому большому разведению, при котором агглютинация еще имеет место. Агглютинированные клетки образуют непрочную сеть, которую можно еще раз ресуспендировать после осаждения. При этом, вновь осев на дно, эти клетки, как и в первый раз, покроют его ровным слоем. При использовании гипериммунных сывороток с высокой концентрацией антител можно наблюдать торможение агглютинации, называемое прозонним эффектом. Было высказано два предположения о природе этого явления. Одно из них зключается в том, что данный эффект аналогичен торможению образования осадка при количественной преципитации, когда в условиях большого избытка антител каждая клетка покрывается своими молекулами антител, и вероятность сшивки двух клеток одной молекулой сильно уменьшается. Во втором случае предполагается существование некоторых видов малоэффективных антител, которые связываются с участками на молекулах антигенов, но не вызывают при этом агрегации клеток [7]. Прозонный эфф

страница 21
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.07.2017)