Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

ельную часть общей концентрации антител [S]t, она будет расти приблизительно линейно с увеличением концентрации лиганда. Однако чем больше антител входит в состав комплексов, тем наклон кривой становится все меньше и меньше и концентрация комплекса [SL] асимптотически приближается к уровню плато [S]t, когда все антитела оказываются связанными с лигандом. На основе такой кривой насыщения связывания можно определить концентрацию связывающих участков антител, если принять ее равной концентрации меченого лиганда, связанного в состоянии насыщения (лиганд метят радиоактивным изотопом или каким-либо другим способом1). Эту величину иногда называют антигенсвязывающей емкостью.

1 Это предположение абсолютно верно только для моновалентных лигандов, однако •большинство поливалентных лигандов при сильном избытке антигена (а именно в этих условиях производится измерение уровня плато) эффективно ведут себя как моновалентные лиганды. Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер

Общая концентрация лиганда, при которой антитела начинают насыщаться, есть функция не только концентрации антител, но также и константы ассоциации Касс, называемой часто аффинностью (или сродством). Эта константа имеет размерность М"1 или л/моль [если все концентрации в уравнении (2) молярные]. Поэтому величина Kacc [L] оказывается безразмерной. Именно отношение этой величины к единице, как видно из уравнения (3'), показывает, насколько насыщены антитела. Например, антитела с аффинностью 107 м-1 не будут насыщены, если концентрация лиганда равняется 10"8М (Касс [L] = 0,1), даже если общее количество лиганда значительно превышает общее количество антител. Из уравнения (3') следует, что при этом связанные антитела будут составлять только 0,1/1,1, или около 9%. Данный аспект аффинности, а также способы ее измерения рассматриваются значительно детальнее в следующем разделе.

23.1.1.2. Свободная энергия

Аффиность Касс имеет важнейшее значение и с точки зрения термодинамики, так как она прямо связана со свободной энергией реакции следующими уравнениями:

Дрт= - RT In Кясс (4)

или

*acc = e-AF0/Rr (4'}

где R — это универсальная газовая постоянная (1,98717)кал/(К-моль), Т — абсолютная температура в градусах Кельвина, In — натуральный логарифм, а е — основание натуральных логарифмов. Знак минус введен в соответствии с договоренностью, по которой положительное связывание сопровождается отрицательным изменением свободной энергии. A F° — стандартное изменение свободной энергии, определяемое как изменение свободной энергии при реакции 1 моля антигена и 1 моля связывающих участков антител, в ходе которой образуется 1 моль комплексов в расчете на единицу концентрации.

Важно отметить очевидное различие уравнений (4) и (4'). Как следует из уравнения (2), Касс имеет размерность М-1 (т.е. л/моль), в то время как в уравнении (4') эта величина безразмерная. Причина такого несоответствия заключается в том, что в уравнении (4'), строго говоря, Кясс должно выражаться через мольные доли, а не через концентрации. Мольная доля растворенного вещества — это отношение молей данного вещества к общему количеству молей всех компонентов раствора. Поскольку вода (55 М) — превалирующий компонент большинства водных растворов, для удобства можно превратить Касс в безразмерное отношение мольных долей, поделив все концентрации в уравнении (2) на 55 М. Такое преобразование делает уравнение (4') строго корректным, но вводит в уравнение (4) дополнительный член, равный — /?Г1п55г который соответствует энтропии разбавления. Этот постоянный член уничтожается при вычитании величин A F, но не при их делении.

Из этих уравнений можно вывести важное мнемоническое правило. Поскольку In 10 = 2,303, то десятикратному увеличению константы связывания соответствует при 37°С (310,15 К) изменение свободной энергии A F, равное лишь 1,42 ккал/моль (аналогичные величины для 25°С и 4°С — 1,36 и 1,27 ккал/моль соответственно). Это меньше одной трети энергии водородной связи (около 4,5 ккал/моль). С другой стороны, очень высокой аффинности 1010 М-1 соответствует AF, равное лишь 14,2 ккал/моль, что приблизительно эквивалентно энергии трех водородных связей. (Конечно, поскольку водород-

23. Взаимодействие антиген—антитело ные связи с водой разрушаются при образовании водородных связей между антигеном и антителом, энергия, приходящаяся на одну водородную связь, оказывается ближе к 1 ккал/моль.) Этот пример с очевидностью показывает, что из многих типов взаимодействий (гидрофобных, ионных, водородных связей), возникающих между контактирующими участками антигена (например, белка) и антигенсвязывающего центра антитела, почти столько же отталкивающих, сколько и притягивающих. Именно небольшое различие в несколько килокалорий между значительно большими величинами, соответствующими суммам взаимодействий притяжения и отталкивания, и ответственно за возникновение «высокой аффинности». Поэтому неудивительно, что небольшие модификации антигена могут приводить к очень большим изменениям сродства. Единственная водородная связь способна изменить аффинность во много раз. Аналогичные рассуждения справедливы и в отношении гидрофобного и других взаимодействий. Все это необходимо будет иметь в виду при обсуждении вопросов, касающихся структуры антигена и специфичности его узнавания антителом.

23.1.1.3. Роль температуры, рН и концентрации соли

Ранее уже говорилось, что КЛСС — величина, постоянная при любом заданном наборе условий, таких, как температура, рН и концентрация соли. Однако при варьировании любого из этих условий Касс может изменяться. Мы видели, что соотношение между свободной энергией и аффинностью зависит от температуры. Тем не менее свободная энергия сама по себе является функцией температуры:

А^0 = АЯ°-ГА5°, (5)

где АН — это изменение энтальпии (тепловой эффект реакции)1, AS — изменение энтропии (величины, характеризующей степень неупорядоченности системы)1, а Т — абсолютная температура, измеряемая в К.

Можно показать, что константа ассоциации Касс зависит от температуры следующим образом:

dln^acc ДЯ° ,fi> dT RT2 ' К >

или, что эквивалентно,

dln^acc -АН» ,fi,. d (i/T) ~~ R К >

Вопрос о том, как были получены эти уравнения, выходит за рамки данной книги (см. руководство Мура [4]). Однако рассмотрим его практическое использование. Во-первых, исходя из наклона графика функции 1пЛГасс от 1/Г, определяют стандартное изменение энтальпии А Н°. Во-вторых, для сильно экзотермического взаимодействия (т.е. связанного с большим отрицательным АН — например образование водородной или полярной связи) аффинность будет уменьшаться с повышением температуры. Следовательно, во многих случаях взаимодействие между антигеном и антителом при 4°С будет сильнее, чем при 25 или 37°С, так что максимальное связывание для данных концентраций может быть достигнуто на холоду. В противоположность этому неполярные или гидрофобные взаимодействия, наоборот, определяются в значительной степени энтропийным членом TAS, а АН0 для них близко к нулю. В этом случае аффинность слабо зависит от температуры.

1 Более полное описание этого вопроса можно найти в любом учебнике по физической химии, например в руководстве Мура [4]. Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер

Что касается влияния рН и концентрации соли (или ионной силы) на аффинность, то оно может быть различным в зависимости от природы взаимодействующих групп. Большинство реакций антиген-антитело изучается при значениях рН, близких к нейтральным, и при физиологических концентрациях соли (0,15 М NaCl). Если связывание осуществляется главным образом в результате ионных взаимодействий, то высокая концентрация соли будет снижать аффинность.

23.1.2. Кинетика реакции антиген-антитело

Фундаментальная связь между термодинамикой и кинетикой реакции антигена с антителом выражается соотношением:

А'аге = (7)

где к{ и к_{ — константы скорости прямой (ассоциация) и обратной (диссоциация) реакций.

Скорость прямой реакции в значительной степени определяется скоростью диффузии [теоретический верхний предел — 109 л/(моль*с)] и вероятностью того, что данное столкновение приведет к связыванию, т.е. главным образом вероятностью правильной ориентации антигена и антитела для соответствующей «подгонки» реагирующих участков. Можно показать [5], что константу скорости диффузии можно приближенно определить с помощью уравнения Смолуховского:

ATdl^4naO(6-1020), (7а)

где а — это выраженная в сантиметрах сумма радиусов молекул обоих реагентов, a D — сумма констант диффузии индивидуальных реагентов, выраженная в см2/с. Множитель 6-Ю20 необходим для приведения величины Kdl к размерности М_1с_1. Например, если а = 10~6 см, a D = 10~7 см2/с, то Кй1 ~ ~ 7,5-10" М-'с-1. Скорости ассоциации для больших белковых антигенов в общем будут ниже, чем для небольших гаптенов. Этот факт может быть обусловлен меньшей величиной D, ориентационными эффектами при сталкивании и другими особенностями белок-белкового взаимодействия, не связанными с диффузией. В результате скорости ассоциации для белковых антигенов по порядку величины чаще всего оказываются равными 105 — 10е М"1^"1 (см. ниже). Этот факт, однако, может частично объясняться лишь меньшей скоростью диффузии. Если радиусы предположительно сферических молекул реагентов равны г1 и г2, то в уравнении (7а) а = ri + т\. В то же время D пропорционально 1/V| -f- 1/г2. Константа скорости диффузии, следовательно, пропорциональна выражению

(г» + г2) (J-+ JL) = (г, + г2Г1г{г2. (76)

Отсюда можно видеть, что если г, = г.2 = г, то выражение (76) просто становится равным 4. Таким образом, в случае взаимодействия двух молекул одинакового размера константа скорости диффузии не будет зависеть от того, являются данные молекулы большими или малыми [6]. Однако, если одна из молекул большая, а другая — малая, то скорость диффузии будет выше, чем в том случае, когда обе молекулы большие. Это происходит из-за того, что уменьшение радиуса г, (когда г2 остается постоянным и большим, чем rt) оказывае

страница 2
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(19.08.2017)