Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

>Зоны

Зона эквива-. лентности

В надосадочной жидкости теперь содержалось больше комплексов антиген— антитело, так как в избытке антигена их размеры уменьшились настолько, что комплексы стали растворимыми. Свободные антитела при этом не обнаруживались.

Все эти наблюдения можно объяснить в рамках модели преципитации, называемой теорией решетки [117, 118]. В данной модели предполагается, что антитела являются поливалентными, а антигены—би- или поливалентными. Это дает возможность образоваться длинным цепям, в которых антитело связано с антигеном, связанным в свою очередь с другим антителом, и так далее. Чем больше будет размер агрегатов, тем в меньшей степени продукт окажется растворимым. В условиях, соответствующих зоне избытка антител, появляются точки ветвления на тех молекулах антигена, которые связаны с тремя антителами. Наличие таких точек приводит к образованию больших нерастворимых комплексов. Например, если отношение антитело/антиген будет равно 3:1, то в среднем каждая молекула антигена окажется связанной с тремя молекулами антител, что приведет к формированию трехмерной решетчатой структуры. Если же антитела и антиген присутствуют в эквимолярных концентрациях (это соответствует точке эквивалентности), то вероятность связывания данной молекулы антигена более чем с Двумя антителами станет меньше. В результате количество точек ветвления понизится и продукт будет представлять собой множество длинных разветвленных цепей, в которых молекулы

3* Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер

антител и антигена чередуются друг с другом. По мере увеличения концентрации антигена в преципитате начинают преобладать линейные цепи с экви-молярным соотношением антител и антигена. При дальнейшем возрастании концентрации антигена все большее количество его молекул становится связанным лишь с одним антителом или находится в свободном состоянии. Поскольку связывание антигена только с одним антителом означает обрыв цепи, то в результате в растворе будут обнаруживаться цепи все меньшей длины. В конце концов комплексы антиген—антитело окажутся настолько малыми, что опять станут растворимыми. Такие „иммунные комплексы" существуют в условиях, соответствующих зоне избытка антигена, когда свободные антитела не обнаруживаются.

В теории решетки не только на статистическом уровне объясняются явления, связанные с преципитацией, но, кроме того, делается важное предсказание о бивалентности или поливалентности антител. При дальнейших структурных исследованиях антител (гл. 7) были выяснены их молекулярные массы и валентность. Антитела действительно оказались бивалентными, за исключением IgM, которые функционально пятивалентны, и, следовательно, образуют преципитаты еще более эффективно.

Антигены могут быть поливалентными благодаря тому, что имеют либо множество копий одной и той же детерминанты, либо много различных детерминант, каждая из которых взаимодействует со своей субпопуляцией антител из гетерогенной антисыворотки. Выше был рассмотрен пример, иллюстрирующий возможности реакции преципитации для изучения поливалентного антигена, все детерминанты которого одинаковы. У полисахаридов наиболее иммуноген- " ные антигенные детерминанты часто находятся на невосстанавливающих концах цепи. Поэтому разветвленные полисахаридные цепи, имеющие больше одного конца, обычно поливалентны. Неразветвленные цепи декстрана (полимера глюкозы) ведут себя как моновалентные при взаимодействии с антидекстрановыми антителами, направленными против концевых участков цепей и не преципити-руются ими [73]. Однако существует еще одна группа антидекстрановых антител, специфичных к внутренним участкам полиглюкозных цепей. Поскольку в декстране имеется множество подобных участков, по отношению к таким антителам он будет поливалентным. В результате с помощью неразветвлен-ного декстрана оказывается возможным различать антитела, специфичные к концевым и к внутренним участкам цепей, ибо преципитация будет наблюдаться лишь со вторыми из них [73, 81]. Мономерные антигены белковой природы, такие как миоглобин (см. выше) или лизоцим, являют собой примеры антигенов второго типа, поскольку по отношению к гетерогенным антисывороткам они ведут себя как поливалентные, а по отношению к моноклональным антителам — как моновалентные. Это следует из того, что молекулы таких антигенов содержат множество антигенных детерминант, но лишь по одной копии каждой из них. Таким образом, при добавлении полиспецифической антисыворотки, содержащей антитела, направленные против нескольких детерминант антигена, каждая молекула окажется способной связать более одного антитела, что в результате будет приводить к образованию решетки. В то же время при использовании антител, специфичных по отношению к одной детерминанте (например, моноклональных антител), преципитации наблюдаться не будет. В данном случае реакция антиген— антитело количественно может быть охарактеризована с помощью одного из описанных ранее методов, например РИА или ИФА. 23.6.2. Иммунодиффузия

Чаще всего иммунопреципитация используется в сочетании с какой-либо системой диффузии [119]. Диффузию можно наблюдать при добавлении капли растворе белка в чашку с водой (добавлять белок следует осторожно, чтобы не вызвать перемешивания жидкости). Скорость перемещения молекул белка в жидкости, согласно закону Фика, пропорциональна произведению градиента концентрации на коэффициент диффузии белка:

-5—(45)

где Q — это количество вещества, проходящее через сечение площади А за

de

время t, D — коэффициент диффузии, зависящий от размера молекул, а ^ —

градиент концентрации. Поскольку молекулы антител довольно велики, их коэффициенты диффузии оказываются весьма малыми, так что в большинстве систем за один день фронт диффузии распространяется лишь на 5—20 мм. Чтобы жидкая фаза в течение столь долгого времени оставалась стабильной» диффузию обычно проводят в геле, препятствующем перемешиванию, но не затрудняющем передвижения молекул белка. Практика показала, что 0,3 — 1,5% агара или агарозы позволяют белкам такого размера, как антитела, двигаться свободно и в то же время ослабляют механические и термические потоки в жидкости. Если тщательно подобрать концентрации антигена и анти-тител, то с помощью данной системы можно определять количество присутствующих в смеси антигенных компонентов и концентрацию каждого из них. Кроме того, иммунодиффузия позволяет путем варьирования геометрии входящих в состав геля реагентов получать полезную информацию как об антигенах (их идентичности, различиях, частичном перекресте, чистоте), так и об антителах (например, об их специфичности). Ниже рассматриваются четыре наиболее широко используемые схемы проведения иммунодиффузии.

23.6.2.1. Диффузия одного компонента в одном направлении

В данном методе антитела вводят в гель, находящийся внутри стеклянной трубки. Раствор антигена наслаивают на гель, после чего молекулы антигенов начинают диффундировать внутрь геля (рис. 23.20,4). Через определенное время концентрация антигена а в некотором месте становится равной концентрации антител к этому антигену (т.е. достигается точка эквивалентности), что приводит к образованию там полосы преципитации в tt. По мере диффузии антигена его концентрация будет возрастать и в конце концов антиген окажется в избытке по отношению к антителам. Это вызовет растворение полосы преципитации rt и смещение ее в направлении диффузии к 14. Интегрируя уравнение Фика, получим, что пройденное расстояние пропорционально квадратному корню от времени. Если диффундируют два различных антигена, а и б, а антисыворотка содержит антитела против них обоих, то образуются две независимые полосы, движущиеся с независимыми друг от друга скоростями. При этом скорость движения каждой полосы будет определяться концентрацией соответствующего антигена в образце, его коэффициентом диффузии (размером) и концентрацией специфичных к нему антител в агаре. Одна-нако, поскольку полосы со временем перемещаются, использование описанного метода для получения количественных характеристик наталкивается на определенные трудности.

23.6.2.2. Диффузия одного компонента в двух направлениях (метод Манчини)

В данном методе [120], как и в предыдущем, антитела предварительно вводят в гель, однако диффузия антигена идет не в одном, а в двух направлениях (рис. 23.20,i>). Раствор, содержащий антиген а, вносят в небольшую лунку, вырезанную в геле, сформированном в чашке Петри. Таких лунок делается несколько, и в каждую из них антиген добавляют после очередного разбавления. Внесенный антиген начинает диффундировать, вследствие чего вокруг каждой лунки возникает градиент его концентрации. Когда на некотором расстоянии от лунки концентрация антигена достигнет точки эквивалентности, вокруг лунки появится кольцо преципитации соответствующего радиуса. Чем выше была первоначальная концентрация антигена в лунке, тем на большее расстояние он продиффундирует до того, как сформируется кольцо, и тем шире будет это кольцо. Площадь кольца прямо пропорциональна начальной концентрации антигена. Данный метод представляет собой удобный количественный тест, широко используемый при определении класса иммуноглобулинов. С этой целью тестируемую сыворотку вносят в лунку, а антисыворотки против каждого класса иммуноглобулинов добавляют в агар. Чувствительность можно увеличить путем понижения концентрации антисыворотки в геле. При этом размеры кольца увеличиваются, поскольку антигену для образования кольца необходимо будет иметь меньшую концентрацию. Однако антисыворотку нельзя разбавлять слишком сильно, поскольку тогда преципитация вообще не будет иметь места.

23.6.2.3. Диффузия двух компонентов в одном направлении

Внутри стеклянной трубочки находится гель, приготовленный на основе чистой агарозы. Один конец трубочки погружают в раствор, содержащий антиген а, а на противоположный торец наносят антитела против антигена а. В течение первых нескольких часов антиген и антитела будут диффундировать навстречу друг другу (рис. 23.20,5), пока, наконец, не встрет

страница 19
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.04.2017)