Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

о (хотя это пока и не доказано), что в антигенсвязывающем центре антитела имеется комплементарная выпуклость, которая при взаимодействии антитела с антигеном попадает в эту впадину. На основе данных по изучению миеломных белков, связывающих небольшие гаптены или углеводы, принято считать, что антиген заполняет собой некоторую полость или трещину на антителе [112]. Однако в случае антигенов, представляющих собой глобулярные белки, ситуация оказывается структурно более симметричной (а связывание антигена с антителом является к тому же и термодинамически симметричным). В результате обе модели, в одной из которых выпуклость на антителе соответствует впадине на антигене, а в другой, более традиционной, наоборот, впадина на антителе соответствует выпуклости на антигене, становятся равновероятными. В настоящее время, когда можно получить моноклональные антитела против любых антигенов белковой природы, по-видимому, будут обнаруживаться оба типа комплементарности. Не исключено, что именно наличие у детерминанты, изображенной на рис. 23.18, впадины, как раз и обусловливает узнавание этой детерминанты антигенсвязывающим центром антитела.

Более полная информация по данному вопросу содержится в специальных обзорах [89, 96, 112].

23.5.4.1. Конформационное равновесие у антигенных детерминант белковой и пептидной природы

Мы уже обсуждали тот факт, что антитела, полученные против нативного белка, обладают более высокой аффинностью к нативной, чем к какой-либо другой конформации, принимаемой полипептидной цепью в результате фраг-ментирования или денатурации. Аналогичным образом антитела, полученные против фрагментов или денатурированных молекул, имеют большую аффинность именно к ним, а не к нативной конформации белка. В данной части мы обсудим возможные механизмы возникновения подобных различий в аффинности и выясним, каким образом такие различия можно использовать при изучении конформационного равновесия в белках и пептидах.

Предложено несколько механизмов, с помощью которых можно объяснить, почему антитела, специфичные к нативному белку, связываются с пептидным фрагментом, находящимся в случайной конформации, с более низкой аффинностью. Конечно же, в пептиде могут отсутствовать некоторые из остатков, входивших в состав антигенной детерминанты и контактировавших с антителом. Поэтому естественно, что энергия связывания его с антителом будет меньше. Однако существуют и другие механизмы, за счет которых аффинность пептида к антителам может уменьшаться даже в тех случаях, когда в пептиде присутствуют все контактирующие остатки. Во-первых, взаимное расположение этих остатков может не столь хорошо соответствовать структуре антигенсвязывающего центра антитела, как у белка, находящегося в нативной конформации. Во-вторых, не исключено, что функциональная аффинность

23. Взаимодействие антиген—антитело оказывается пониженной из-за того, что в каждый момент времени лишь небольшая часть молекул пептида имеет конформацию, близкую к нативной. В данной модели предполагается, что антитела связываются только с теми молекулами, которые находятся в нативной конформации. Поскольку такие молекулы составляют лишь ПК часть всех молекул пептида (К — константа конформационного равновесия пептида), то в соответствующее число раз уменьшится и величина функциональной аффинности (см. ниже). Эта модель по сути аналогична аллостерической модели. В-третьих, возможно, что при первоначальном связывании антитела с пептидом, находящимся в ненатив-ной конформации, имеет место неполная комплементарность. Однако затем вследствие внутримолекулярных изменений пептид переходит в состояние минимума энергии и принимает конформацию, близкую к нативной. Данная гипотеза, называемая гипотезой промежуточного состояния, аналогична модели индуцированного соответствия. Уменьшение аффинности в ней обусловлено тем, что для изменения конформации пептида требуется определенная энергия, от величины которой зависит значение константы конформационного равновесия, фигурирующей во второй гипотезе. Какая из этих моделей справедлива в действительности, можно с некоторой степенью достоверности выяснить с помощью кинетических экспериментов, поскольку первая гипотеза предсказывает более высокие скорости «прямой» и «обратной» реакций, чем вторая [54].

Хотя с помощью второй гипотезы невозможно объяснить все имеющиеся данные, тем не менее она оказалась полезной, поскольку на ее основе был предложен метод оценки констант конформационного равновесия в белках и пептидах [95, 114]. Исходя из этой гипотезы, можно записать:

где А — антитела, Пн — нативный пептид, Псл — пептид, находящийся в случайной конформации. И тогда:

^функц ~ ^конф X ^нативн- (44)

Таким образом, отношение значения наблюдаемой константы ассоциации антитела с пептидом к константе ассоциации антитела с нативной молекулой должно равняться константе конформационного равновесия пептида. Необходимо отметить, что в данном случае полная концентрация пептида принимается приблизительно равной [Псл]. Обычно это предположение оказывается справедливым, поскольку для большинства пептидных фрагментов лишь незначительная их часть находится в нативной конформации, т. е. величина ^ж>нф= [ПН]/[ПСЛ] оказывается много меньше единицы. Кроме того, надо сказать, что если в какой-то степени верны первая или третья гипотезы, то получаемое с помощью данного метода значение .Кконф будет завышенным. С другой стороны, если меньшая аффинность пептида обусловлена отсутствием некоторых контактирующих с антителом остатков антигенной детерминанты, то величина Кконф окажется заниженной (поскольку в данном методе предДж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер

полагается, что все различие в аффинности обусловлено конформационными эффектами). Две эти ошибки могут до некоторой степени взаимно скомпенси-роваться. Полученная с помощью данного метода величина Ккт$ одного из пептидных фрагментов стафилококковой нуклеазы .оказалась равной 2-Ю-4 [95]. Использование антител, специфичных к этому фрагменту, дало возможность оценить, какую часть времени нативная нуклеаза проводит, находясь в ненативной конформации. В данном случае она оказалась близкой к 1/3000.

23.6. Другие методы

У нас осталось место для обсуждения еще лишь нескольких методов изучения взаимодействия антиген—антитело. Здесь мы не имеем возможности рассказать о таких весьма полезных методах, как тушение триптофановой флуоресценции антител при связывании их с определенными антигенами [115] (чувствительный метод, используемый, например, при изучении кинетики быстрых процессов), а также ингибирование образования стерильных пятен при добавлении антител к конъюгатам антиген-бактериофаг [116] (метод столь же чувствителен, что и РИА, т. е. позволяет обнаруживать весьма малые количества фаговых вирионов).

23.6.1. Количественная преципитация

Способность нейтрализовать патогенные бактерии и образовывать осадок при добавлении к надосадочной жидкости бактериальной культуры была одной из первых известных свойств антител. Оба свойства характеризовались высокой специфичностью по отношению к тому бактериальному штамму, против которого антисыворотка была получена. Осадок состоял из белка антител и бактериального продукта. По мере образования осадка надосадочная жидкость содержала все меньшее количество белка антител и при правильно подобранных условиях в конце концов теряла способность к нейтрализации бактерий. Однако определение количества преципитированных антител оказалось довольно сложной задачей, поскольку осадок содержал и белок антител, и белок антигена. Данную проблему решили Гейдельбергер и Кендолл [117, 118] после того, как обнаружили, что антитела против пневмококков были способны пре-ципитировать очищенный полисахарид из клеточной стенки этих бактерий. В описанном случае весь содержавшийся в преципитированном белке азот принадлежал антителам. График зависимости количества преципитирован-ного белка антител от количества добавленного антигена при неизменном объеме антисыворотки приведен на рис. 23.19.

Как видно на рис. 23.19, количество преципитированных антител сначала возрастает, выходит на плато, а затем опять снижается. Было обнаружено, что максимальная преципитация совпадает с полным истощением нейтрализующих антител. Это происходит в точке, называемой точкой эквивалентности. Количество белка антител преципитировавшего в точке эквивалентности, должно быть равно полному количеству специфических антител в данном объеме. Та часть графика, где кривая идет вверх, называется зоной избытка антител (или недостатка антигена), а та часть, где она идет вниз, — зоной избытка антигена.

Для каждой из зон графика, изображенного на рис. 23.19, был проведен тщательный анализ состава осадка и надосадочной жидкости. В условиях недостатка антигена отношение количества антител к количеству антигена в осад-

23. Взаимодействие антиген—антитело ке было высоким. В надосадочной жидкости при этом присутствовали свободные антитела, а антиген не обнаруживался. По мере того как добавлялось все больше антигена, количество антител в осадке росло, но отношение количества антител к количеству антигена падало. В точке эквивалентности надосадочиая жидкость не содержала ни свободных антител, ни антигена. При последующем добавлении антигена количество антител в осадке уменьшалось, однако отношение количества антител к количеству антигена оставалось постоянным.

Рис. 23.19. Количественная иммуно-преципитация. К определенному количеству специфических антител добавляли увеличивающиеся дозы антигена небелковой природы. Показана зависимость количества осажденного белка антител от количества добавленного антигена (А), а также приведены структуры комплексов антиген—антитело для различных относительных количеств обоих реагентов (В). При избытке антигена осадок исчезает, а в надосадочной жидкости обнаруживаются растворимые иммунные комплексы.

А.

Количество осажденного Белка (мкг)

Образующиеся продукты /) оСЭсГ

О *

Отношение антитело/ан-

..тиген 2М

Результат: осаждение

страница 18
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(27.05.2017)