Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

есколько отличной от нативного миоглобина конформации. С другой стороны, при добавлении к нативному (коричневому) миоглобину антител, направленных против апомиоглобина, получается осадок белого цвета. Эти антитела настолько сильно предпочитают не содержащую тема конформацию апомиоглобина, что с их помощью можно фиксировать состояние тех молекул, которые случайно оказались в этой конформации, и, таким образом, сдвигать равновесие в сторону апоформы. Фигурально выражаясь, антитела как бы вытесняют гем из миоглобина. С термодинамической точки зрения это означает, что предпочтение антител к апоформе по сравнению с нативной формой обусловлено большей свободной энергией связывания белка с антителом, чем с гемом. Подводя итог, можно сказать, что при иммунизации образуются антитела, весьма специфичные к конформации белка, используемого в качестве иммуногена.

Миоглобин, кроме того, представляет собой удобный объект для изучения широкого спектра антигенных детерминант, начиная от сравнительно зависимых от последовательности и кончая существующими лишь в нативной конформации белка (рис. 23.16). Типичной детерминантой первого типа является участок последовательности, находящийся в N-концевой части молекулы и включающий остатки 15—22. Впервые Крамптон и Уилкинсон -[97] обнаружили, что получаемый в результате расщепления химотрипсином фрагмент, содержащий остатки 15—29, связывается с антителами, направленными как против нативного, так и против апомиоглобина. Затем две группы исследователей показали, что синтетические пептиды, соответствующие более короткой последовательности 15—22, связываются с антителами, получаемыми против нативного миоглобина кашалота, даже несмотря на то, что содержат лишь 7—8 остатков [91, 98]. Пептиды такой длины не могут, находясь в растворе, в течение длительного времени пребывать в конформации, соответствующей конформации данного участка в составе нативного белка. С другой стороны, аффинность антител к этим пептидам оказывается в несколько сотен раз ниже, чем к нативному белку. Таким образом, даже несмотря на то, что последовательность 15—22 составляет большую часть детерминанты, тем не менее антитела оказываются значительно более специфичными (в смысле специфичности первого типа) по отношению к фрагменту, имеющему нативную конформацию, чем к пептиду со случайной конформацией. Кроме того, не исключено, что в построении данной детерминанты принимают участие другие остатки, находящиеся рядом на поверхности миоглобина, но не входящие в данную последовательность Ч

Ярким примером, подтверждающим важную роль вторичной структуры антигенной детерминанты в узнавании ее антителами, служит пептид, представляющий собой петлю в лизоциме куриного яйца (остатки 64—80) [103]. Эта петля образована дисульфидной связью между цистеиновыми остатками Cys-64 и Gys-80, и, как было показано, служит основной антигенной детерминантой лизоцима [103]. Содержащий данную петлю пептид 60-83, будучи выделенным в свободном состоянии, связывает антитела с высокой аффинностью,

1 Детерминанта 15-29 — это единственная определяемая последовательностью детерминанта миоглобина, существование которой было четко установлено несколькими независимыми группами исследователей. Крамптон и Уилкинсон [97] измеряли антигенную активность получаемого при расщеплении химотрипсином фрагмента 147-153, перекрывающегося с еще одной обнаруженной детерминантой такого типа [99]. Однако существование двух других определяемых последовательностью детерминант [99], соответствующих остаткам 56-62 и 94-100, не подтвердилось при тестировании с помощью других антисывороток, даже когда те были получены от животных того же вида [1001. Результаты аналогичных исследований описаны в работах [101—102]. Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер

однако «открывание» петли путем расщепления дисульфидной связи приводит к исчезновению большей части антигенной активности по отношению к анти-лизоцимным антителам [103].

На другом полюсе требований, предъявляемых к конформации полипептидной цепи, лежат детерминанты, составленные из удаленных друг от друга по первичной структуре остатков, оказавшихся сближенными вследствие свертывания полипептидной цепи. Примеры таких, называемых топографическими, детерминант также имеются в миоглобине. Из шести различных изученных Берзофским и др. [13, 90] типов моноклональных антител к миогло-бину кашалота ни одни антитела не связывались ни с каким из фрагментов,

Рис. 23.17. Стереоизображение объемной компьютерной модели миоглобина кашалота на основе координат атомов, полученных Такано [93] с помощью рентгеноструктурно-го анализа. Данная ориентация белка (та же самая, что и изображенная на рис. 23.16), произвольно названа «видом спереди». Компьютерный способ получения стереоизображений описан Фелдманом и др. [94]. Гем и атомы углерода ароматических колец показаны самым темным цветом. Затем по порядку от темного к светлому следуют: атомы кислорода карбоксильных групп, другие атомы кислорода, атомы азота первичных аминогрупп, другие атомы азота и,

наконец, боковые цепи алифатических остатков. Атомы полипептидного «скелета» и боковых цепей неалифатических остатков показаны белым цветом. На данном рисунке, в отличие от рис. 23.16, направления а-спи-ралей не указаны. Остатки Glu-4, Lys-79 и His-12, как полагают, входят в состав топографических антигенных детерминант, узнаваемых моноклональными антителами к миоглобину. ([90]; с изменениями.) Трехмерное изображение можно получить, рассматривая данную стереопару с помощью соответствующего приспособления, например недорогого «стереоскопа».

получаемых при расщеплении белка с помощью бромциана и составляющих вместе полную молекулу. Следовательно, эти моноклональные антитела (все они имеют аффинность от 2• 108 до 2-10" М-1) высокоспецифичны по отношению именно к нативной конформации. Затем данные антитела были исследованы путем сравнения величин их относительной аффинности к ряду выделенных из различных видов животных нативных миоглобинов, аминокислотные последовательности которых были известны. Использование таких миоглобинов позволило идентифицировать некоторые остатки, участвующие в связывании с антителами трех из шести данных типов. Удивительным оказалось то, что два из этих трех типов антител узнавали топографические детерминанты (в том смысле, в котором они были определены выше). Антитела первого клона узнавали детерминанту, включающую в себя остатки Glu 4 и Lys 79, входящие соответственно в состав А-спирали и колена E-F, но находящиеся на расстоянии 2 А друг от друга и образующие в нативной молекуле солевой мостик (рис. 23.17). Антитела другого клона узнавали детерминанту, включающую

23. Взаимодействие антиген—антитело в себя остаток Glu 83, располагающийся на колене E-F, а также остатки А1а-144 и Lys-145, принадлежащие Н-спирали (рис. 23.18). Опять же, эти остатки удалены друг от друга в аминокислотной последовательности, но вследствие свертывания полипептидной цепи оказались в нативной конформации сближенными на расстояние 12 А. Аналогичные данные недавно были получены для моноклональных антител, направленных против миоглобина человека [104] и лизоцима [105]. Кроме того, в некоторых случаях существование подобных конформационно-зависимых антигенных детерминант было предположено на основе результатов исследований, проведенных с помощью

Рис. 23.18. Стереоизображение объемной модели миоглобина кашалота, построенное с помощью компьютера. Показан вид слева, полученный путем поворота на 90° модели, изображенной на рис. 23.17. Атомы закрашены так же, как и на рис. 23.17. Остатки Glu-83, Ala-144 и Lys-145, как считается,

входят в состав топографической антигенной детерминанты, узнаваемой антимиоглоби-новыми моноклональными антителами второго клона [90]. Обратите внимание на наличие впадины на поверхности молекулы примерно в центре антигенной детерминанты между Glu-83 и Ala-144/Lys-145 [90].

поликлональных сывороток, специфичных к таким белкам, как инсулин [106], гемоглобин [107], белок вируса табачной мозаики [108] и цитохром с [109].

Насколько часто в поликлональных антисыворотках встречаются антитела, специфичные к топографическим детерминантам по сравнению с антителами, связывающимися с одним протяженным фрагментом полипептидной цепи? Этот вопрос изучали Ландо и др. [110], пропускавшие козьи, бараньи и кроличьи антисыворотки к миоглобину кашалота через колонки с сефарозой, на которой были иммобилизованы фрагменты, полученные в результате расщепления миоглобина с помощью бромциана и составляющие вместе всю последовательность молекулы. Антисыворотки пропускались последовательно и повторно через каждую из трех колонок до тех пор, пока адсорбция антител не прекращалась. Однако после такой процедуры в каждой из сывороток 30—40% первоначально присутствовавших антител оставались несвязанными. Эти антитела тем не менее обладали высокой аффинностью по отношению к нативной молекуле миоглобина, но, как было показано с помощью РИА, не связывались в растворе ни с одним из фрагментов. Таким образом, во всех четырех тестируемых антимиоглобиновых сыворотках от 60 до 70% антител могли связываться с пептидами, а от 30 до 40% — только с белком, имеющим ин-тактную нативную конформацию.

На основе результатов, полученных в серии подобных исследований, было предположено, что значительная часть поверхности любого белка способна проявлять антигенные свойства [111]. При этом поверхность можно разделить Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер

на отдельные антигенные области [90, 101, 102, 104], каждая из которых состоит из многих перекрывающихся детерминант, узнаваемых различными антителами.

Анализируя результаты описанных выше исследований, можно сделать еще одно интересное предположение, касающееся топографии антигенных детерминант белковой природы. На стереоизображении (рис. 23.18) видно, что составляющие антигенную топографическую детерминанту остатки 83, 144 и 145 миоглобина кашалота располагаются по разным сторонам глубокой щели или впадины на поверхности белка. Не исключен

страница 17
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(27.05.2017)