Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

о связанный с ферментом антиген 2 будет также сорбироваться на твердой фазе. Количественно это будет проявляться как увеличение поглощения в результате проведения катализируемой ферментом реакции. Данный метод был использован для изучения перекрестных реакций антиидиотипических сывороток с двумя препаратами идиотипа, а также для обнаружения анти-антии-диотипических антител (см. гл. 9 и 22). Возможны и другие варианты взаимного расположения антител и антигена. Наличие в «сэндвиче» дополнительных слоев может приводить к повышению чувствительности, однако оно вызывает увеличение фона и вариабельность получаемых результатов.

Примером использования первой из описанных выше схем служит обнаружение человеческих антител к вирусу гриппа [52] (см. рис. 23.10). Лунки, располагающиеся в соседних колонках планшет, покрывались поочередно вирусом гриппа и бычьим альбумином. Разбавленную в 10 раз сыворотку добавляли в два верхних ряда лунок каждой пары колонок и последовательно разбавляли четырехкратно в направлении сверху вниз. Последняя окрашенная лунка указывает на титр, а отсутствие окрашивания в лунках, покрытых альбумином, свидетельствует о специфичности. Еще одно использование этого метода связано со скринингом супернатантов культур при получении моно-

23. Взаимодействие антиген—антитело клональных антител. Чувствительность и скорость метода ИФА делает возможным его использование для скрининга большого количества образцов при получении специфических антител. Клоны, отобранные по этому методу, обычно имеют высокое сродство к антигену. Возможно, это обусловлено диссоциацией антител с низкой аффинностью при отмывке.

Рис. 23.10. Типичный пластиковый планшет, используемый в методе ИФА прямого связывания. Лунки планшета разделены на несколько секций, в каждой из которых имеются 2 колонки. Ячейки всех секций, находящихся в левой колонке, покрывали вирусом гриппа, а в правой — бычьим сывороточным альбумином. Тестируемые образцы противовирусных антител добавляли в верхние ячейки каждой секции и затем

проводили четырехкратное разбавление в направлении сверху вниз. Результаты контрольного титрования известной стандартной антисыворотки показаны в колонках 2 и 3. В качестве проявляющего реагента использовали ковалентно сшитые с ферментом козьи антитела против иммуноглобулинов человека. (Фото любезно предоставлено R. Yarchoan и D. L. Nelson.)

23.4. Специфичность и перекрестные реакции

Специфичность антител (или антисыворотки) определяется по их способности отличать антиген, против которого они были получены (гомологичный антиген, или иммуноген), от любого другого антигена. На практике невозможно проверить все антигены, поэтому обычно тестируют только отдельные антигены, имеющие что-то общее с иммуногеном. Специфичность, понимаемая таким образом, может быть определена только экспериментально и лишь для того набора антигенов, который был отобран для сравнения. Каруш [28] дал определение родственного термина — избирательности — как способности антител различать по принципу «все или ничего» два сходных лиганда. Таким образом, избирательность зависит не только от относительной аффинности антитела Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер

к двум лигандам, но и от экспериментально найденной нижней границы обнаружения взаимодействия. Например, антитела против какого-либо углевода, аффинность которых к данному иммуногену составляет 108 М-1, будут считаться высокоизбирательными, поскольку в 100 раз меньшая аффинность (10s М-1) к сходному углеводу экспериментально не обнаруживается. С другой стороны, антитела, связывающиеся с иммуногеном с аффинностью, равной 109 М-1, могут показаться менее избирательными, поскольку в 100 раз меньшая аффинность к сходному лиганду будет обнаруживаться довольно легко.

В отличие от избирательности, иммунологический перекрест определяется как способность взаимодействовать со сходными лигандами, отличными от иммуногена. Чаще всего этот термин употребляется по отношению к лиганду. Иными словами, если антиген Y связывается с антителами, полученными против антигена X, то говорят, что Y перекрестно реагирует с X. Отметим, что в указанном смысле перекрестно реагируют друг с другом антигены, а не антитела. Тем не менее перекрест двух антигенов X и Y может быть определен лишь по отношению к данным конкретным антителам или конкретной антисыворотке. Например, может оказаться, что какая-то другая группа антител против X совсем не взаимодействует с Y, так что по отношению к этим антителам Y не будет перекрестно реагировать с X. Можно использовать тот же термин еще в одном смысле, говоря, что некоторые антитела против X перекрестно реагируют с антигеном Y.

В большинстве случаев перекрестно реагирующие лиганды имеют к данным конкретным антителам более низкую аффинность, чем иммуноген. Однако имеются и исключения, когда перекрестно-реагирующие антигены связываются с антителами с более высокой аффинностью, чем собственно иммуноген. Это явление называется гетероклитичностъю, а антиген, обладающий большей аффинностью к антителам, чем иммуноген,— гетероклитичным. Антитела, проявляющие такие свойства, также называются гетероклитичными. Хорошим примером гетероклитичных антител служат антитела мышей линии C57BL/10, полученные против гаптена нитрофенилацетата (НФ). Эти антитела, как показали Мекеле и др. [53], связываются с перекрестно реагирующим гаптеном нитро-иодофенилацетилом (НИФ) с более высокой аффинностью, чем с НФ.

Во многих реальных ситуациях наличие иммунологического перекреста обнаруживается методом преципитации, например преципитацией в агаре (метод Ухтерлони), гемагглютинации (описание обоих методов см. ниже) или сходных методов. Все эти методы характеризуются неспособностью отличать разницу в аффинности от разницы в концентрации, что в сочетании с гетерогенностью иммунных сывороток по составу привело к неоднозначности в употреблении терминов иммунологический перекрест и специфичность. С появлением РИА данная неоднозначность в терминологии, а также в интерпретации получаемых результатов стала очевидной.

Учитывая это, Берзофски и Шехтер [54] недавно предложили различать два типа специфичности и, соответственно, два типа реакций иммунологического перекреста, соответствующие двум различным кривым конкуренции в РИА, изображенным на рис. 23.11.

Иммунологическим перекрестом первого типа, или истинным перекрестом, называется способность двух лигандов связываться с разной аффинностью с одним и тем же участком на одной и той же молекуле антитела. Например, похожие гаптены динитрофенил (ДНФ) и тринитрофенил (ТНФ) могут с различной аффинностью реагировать с антителами, полученными к ДНФ. В белковых антигенах подобное различие может возникать при небольжих изменениях первичной последовательности (например, при консервативной

23. Взаимодействие антиген—антитело замене треонина на серии) или при изменении конформации (например, при расщеплении белка на фрагменты) (рис. 23.12). Если пептидный фрагмент содержит все контактирующие остатки антигенной детерминанты (т. е. все те остатки, которые контактируют с антигенсвязывающим центром антитела), то он, в принципе, мог бы взаимодействовать с антителами, полученными против нативной детерминанты, хотя и с меньшей, чем нативный белок, аффинностью (уменьшение аффинности обусловлено тем, что конформации пептида будет отличаться от нативной). Явление иммунологического перекреста первого типа проиллюстрировано на рис. 23.11 (кривая, конкурента СА).

log концентрации лиганда

Рис. 23.11. Графики зависимости R (отношение концентраций связанного с антителами и свободного меченого лиганда) от концентрации немеченого лиганда, построенные для иммуногена L и двух перекрестно реагирующих с ним лигандов Са и Cjj. Между Са и L имеет место иммунологический перекрест первого типа, или истинный иммунологический перекрест (об этом свидетельствует следующее: во-первых, при больших концентрациях немеченого СА меченый лиганд вытесняется полностью, и, во-вторых, аффинность антител к СА ниже, чем к L). Для Св характерен иммунологи-

ческий перекрест второго типа, или частичный перекрест (что следует из существования плато на уровне, соответствующем неполному вытеснению). Отметим, что аффинность Св к антителам совсем не обязательно должна быть меньше, чем у иммуногена L. R — это отношение концентраций связанного и свободного радиоактивномеченных лигандов, a R„ — предельное значение R, получаемое в том случае, когда концентрации всех лигандов, включая меченые, приближаются к нулю ([54]; печатается с разрешения).

Видно, что при достаточно высоких концентрациях немеченого Са метка будет полностью вытеснена из комплексов с антителами. Однако в этом случае для вытеснения определенной части метки требуется более высокая концентрация лиганда, чем в случае иммуногена L.

Иммунологическим перекрестом второго типа, или частичным перекрестом, называется способность перекрестно реагирующего лиганда взаимодействовать с некоторой субпопуляцией антител в гетерогенной сыворотке. Следовательно, данный тип иммунологического перекреста возможен лишь тогда, когда популяция антител гетерогенна (что, однако, справедливо для большинства обычных антисывороток). В этом случае аффинность перекрестно реагирующего лиганда может оказаться не меньше, чем аффинность иммуногена, т. е. кривая, описывающая вытеснение метки из комплексов с антителами, совсем не обязательно должна сдвигаться вправо. Следует, однако, заметить, что при перекресте второго типа данная кривая будет выходить на плато не при полном вытеснении метки (рис. 23.11, кривая конкурента Св). В качестве примера рассмотрим белок, имеющий детерминанты X и Y.

Рис. 23.12. Изображение пространственной структуры N-концевого участка {5-цепи гемоглобина. А. Первые 11 остатков 6А-це-пи. Б. Соответствующий участок в8-цепи. Замена Glu-б в белке дикого типа на валин приводит к появлению новой антигенной детерминанты, на которую могут быть получены антитела [55, 56]. В. Тот же фрагмент, что и на рис. А, но развернутый при денату

страница 11
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(25.11.2017)