Биологический каталог




Иммунология. Том 3

Автор У.Пол

нализа Скэтчарда. Кроме того, в этом случае в графике Скэтчарда на участке, соответствующем большим значениям B/F, будет появляться плато, поскольку если 20 % метки всегда остаются в свободном состоянии, то B/F никогда не сможет превысить 4 (т. е. 0,8/0,2). Для внесения потенциально весьма существенной поправки на данный эффект необходимо всякий раз определять концентрацию иммунологиче-ски неактивной метки в каждой партии антигена и вычитать ее из F и Т. Если В и F измеряются независимо, а Т вычисляется как их сумма (а не просто равняется общей концентрации антигена, включая немеченый конкурирующий антиген), то удобный способ вносить поправки без каких бы то ни было предположений относительно величины Т сводится к следующему: вычисляют отношение В/Т = В/ (В + F), вносят поправку путем деления на долю метки, являющуюся иммунологически активной (в приведенном выше примере эта доля равнялась 0,8) и затем определяют B/F, используя уравнение (38).

23.3.4. Неравновесный РИА

До сих пор мы предполагали, что меченый и немеченый антигены добавляются одновременно, и при этом время инкубации достаточно велико для того, чтобы система смогла перейти в состояние равновесия. Конечно же, при определении аффинности должно быть достигнуто равновесие. Однако предположим, что единственная цель нашего эксперимента заключается в измерении с помощью РИА концентрации конкурента. В этом случае оказывается возможным существенно повысить чувствительность метода, если сначала нанести немеченый конкурент, позволяя ему свободно взаимодействовать с антителами, а затем — добавить меченый антиген и через небольшой промежуток времени провести измерения. Интервал времени должен быть достаточно малым, чтобы равновесие не успело установиться. В такой постановке эксперимента дается существенное преимущество конкурирующему антигену. Можно показать, что в данном случае наклон кривой графика «доза — эффект» (зависимости B/F от общей концентрации добавленного антигена), численно характеризующий чувствительность эксперимента, в области низких доз будет увеличиваться. Подробный математический анализ этой процедуры можно найти в работе Родбардаидр. [49]. Отметим, однако, что использование подобных неравновесных условий требует очень тщательного контроля за временем и температурой.

23.3.5. Иммуноферментный анализ (ИФА)

Существует еще одна твердофазная система, позволяющая изучать реакции антиген—антитело. В основе ее лежит так называемый иммуноферментный анализ (ИФА) [50J. В принципе единственное отличие ИФА от РИА заключается в том, что антитела и антиген вместо того, чтобы связываться с радиоактивным изотопом, ковалентно пришиваются к какому-либо ферменту, после чего определяется связанная ферментативная активность (а не связанная радиоактивность). Растущая популярность ИФА объясняется безопасностью и удобством работы с нерадиоактивными материалами, а также широ-

2* Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер

ким распространением специальных спектрофотометров, с помощью которых за одну минуту можно измерить поглощение в 96 лунках. Поскольку и в ИФА, и в РИА действуют одни и те же термодинамические ограничения, а присутствие фермента может быть обнаружено, если он находится в том же диапазоне молярных концентраций, в котором обычно используются радиоактивные изотопы, то чувствительность и избирательность обоих методов оказываются сравнимыми. Мы рассмотрим четыре основных схемы применения ИФА для обнаружения специфических антител, антигена или перекрестно реагирующих антител.

На рис. 23.94 показана схема непрямого ИФА, представляющего собой простейший способ обнаружения специфических антител в исследуемой антисыворотке и измерения их* концентрации. Антиген нековалентно связывается со стенками каждой лунки пластикового планшета для микротитрования. Именно поэтому оказалось удачным, что большинство белков неспецифично сорбируется на пластик. Избыток свободного антигена отмывается, а лунки инкубируют с раствором альбумина, блокирующего оставшиеся свободными участки неспецифического связывания белков. Затем добавляется тестируемая антисыворотка, и молекулы специфических антител связываются с иммобилизованным на твердой фазе антигеном. При последующей отмывке удаляются несвязавшиеся антитела.

После этого добавляются связанные с ферментом антитела против иммуноглобулинов, узнающие связавшиеся с антигеном специфические антитела. Несвязавшиеся конъюгаты антиглобулин-фермент отмываются, после чего добавляется субстрат. В результате действия фермента на субстрат появляется окрашенный продукт, обнаруживаемый спектрофотометрически по увеличению поглощения.

Хотя данный метод является быстрым и весьма чувствительным, с его помощью часто бывает трудно получить количественные характеристики. В пределах определенного диапазона концентраций увеличение оптической плотности пропорционально количеству специфических антител, добавленных на первом этапе. Однако количество связанных антител измеряется не прямо, поскольку концентрация антител в образце оценивается путем сравнения со стандартной кривой, построенной для известного количества антител. Столь же трудным представляется определение с помощью этого метода аффинности антител, так как иммобилизованность антигена на твердой фазе приводит к повышению функциональной аффинности. Для обнаружения очень малых количеств антител, чувствительность данного метода оказывается вполне удовлетворительной, особенно когда в качестве связанного с ферментом реагента используются аффинно очищенные антитела к иммуноглобулинам. Одни и те же связанные с ферментом антитела против иммуноглобулинов можно использовать для регистрации антител ко многим различным антигенам. В то же время антитела к определенным классам иммуноглобулинов могут быть использованы для выяснения того, в какой степени специфический иммунный ответ обусловлен иммуноглобулинами каждого из классов. Очевидно, что воспроизводимость метода зависит от степени однородности покрытия антигеном стенок каждой из лунок (этот параметр может варьировать), а специфичность зависит от используемого для покрытия стенок очищенного антигена.

На рис. 23.9, Б показан метод обнаружения антигена, основанный на конкуренции. На первом этапе растворенный антиген смешивают с ограниченным количеством специфических антител. Затем смесь добавляют в лунки, стенки которых покрыты антигеном, и обрабатывают так, как показано на рис. 23.9, А . Образование комплексов антиген—антитело на первом этапе будет приводить к снижению количества адсорбировавшихся на стенках анти-

* Фермент

Фермент

Лунка, покрытая антигеном

Специфические антитела

О + х

Антитела против иммуно- .Сэндвич глобулинов, ковалентно сшитые с ферментом

Свободный антиген

Специфические Комплекс

6+ И

Фермент

Ю1

антитела

антиген-антитело антигеном

Лунка, покрытая Антитела не Антитела против имму- .Сэндвич*

связываются ногловулинов, ковалентно не овра-сшитые с ферментом зуется

Фермент

ш * О

+

Фермент

Лунка, покрытая антителами

Антиген

+

Антитела против антигена, Сэндвич* ковалентно сшитые с ферментом

мент

+ •

Фермент

Лунка, покрытая Антитела,специфич-антигеном 1 ные к антигену 1

Антиген 2,ковалентно „Сэндвич сшитый с ферментом

Рис. 23.9. Четыре метода обнаружения специфических реакций антиген—антитело с помощью метода ИФА. А — прямое связывание. Б — торможение связывания в присутствии конкурента. В — схема «сэндвича», в которой центральным элементом является антиген. Г — схема «сэндвича», в которой центральным элементом является антитело. Дж. А. Берзофски, А. Дж. Берковер

тел и, следовательно, к уменьшению поглощения, измеряемого на конечном этапе. Описанный метод позволяет найти аффинность свободного антигена, определяемую половиной тормозящей концентрации антигена. Кроме того, при использовании данной схемы можно оценить степень перекреста между антигеном, находящимся в растворе и на стенках лунки.

На рис. 23.9, В показан используемый для обнаружения антигена так называемый метод «сэндвича». Стенки пластиковых лунок покрывают специфическими антителами, связывающимися затем с антигеном. После этого добавляют вторые антитела, сшитые с ферментом. Они связываются с комплексами антиген—антитело, вследствие чего молекулы фермента оказываются иммобилизованными на твердой фазе. Далее избыток вторых антител отмывают, после чего добавляют субстрат. Измеряемое в этом случае поглощение будет определяться концентрацией антигена в тестируемом растворе, значение которой можно будет определить с помощью стандартной кривой. Специфичность данного метода зависит от специфичности антител, адсорбированных на стенки лунки и используемых для обнаружения антигена. Чувствительность же определяется значениями аффинности и количеством находящихся на стенках первых антител, которое можно увеличить, если на этапе адсорбции использовать аффинно очищенные антитела. Возможность одновременного связывания антигена с антителами обоих типов зависит от того, является ли антиген бивалентным. Если же он моновалентен, то первые и вторые антитела должны обладать специфичностью к различным антигенным детерминантам одной и той же молекулы антигена. В том случае, когда эти антитела связываются с одной мономерной молекулой антигена и представляют собой два различных клона моноклональных антител, с помощью данного метода можно выяснить, могут ли эти антитела одновременно связываться с одной и той же молекулой или же они конкурируют за один участок или за различные, но настолько близкие друг к другу участки, что одновременное связывание невозможно из-за стерических препятствий [51].

На рис. 23.9, Г показано, как метод «сэндвича» может быть использован для обнаружения перекреста антител. Сначала стенки лунки покрывают антигеном 1, после чего добавляют антитела, которые специфично с ним связываются. Избыток антител отмывают и добавляют антиген 2, сшитый с ферментом. Если связавшиеся антитела перекрестно реагируют и с антигеном 2, т

страница 10
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121

Скачать книгу "Иммунология. Том 3" (4.83Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.08.2017)