Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

ами* (сефвдексы) или полиакриламндные гели (биогели) (рис. 11). Они хорошо набухают в воде, образуя гели, которые действуют подобно молекулярному ситу. В настоящее время выпускается более 20 типов сефадексов и более 30 типов биогелей, различающихся частотой поперечных сшивок и размером гранул. Выбор носителя для хроматографической колонки определяется молекулярной массой разделяемых пептидов.

Широко используемым методом разделения крупных пептидов является также ионообменная хроматография, в качестве носителей а этих случаях служат ионообменные целлюлозы: диэтил-аминоэтил-(ОЕАЕ)- и карбоксиметил- (СМ) - и ионообменные полимеры декстрана: DEAE-, СМ-, сульфоэтил-(5Е)-, сульфопро-пил (SP-)- и диэтил-2-гидроксипропил-амииоэтил- (QAE-) сефадексы.

Объем элюента

Рис. 11. Разделение пептидов методом I I. фильтрации.

Гидрофильные свойства таких ионообменников. их способность набухать в водной среде обеспечивают лучшие условия проницаемости для крупных молекул по сравнению со смолами на основе полистирола. Хроматография проводится обычно в водных трис-НО [ (гидроксиметил)амннометан гидрохлорид. H*NC(CHX>H> -- НС1| буферах, содержащих б—8М раствор мочевины. Элюирование пептидов осуществляется при постепенном повышении ионной силы раствора.

Для фракционирования крупных пептидов иногда применяется метод про тивоточного распределения, в котором разделение основано на различной растворимости веществ в не мешивающнхея жидкостях, например фенол — вода или бутанол — вода. Один из вариантов этого метода заключается в простой экстракции пептидов н-бутанолом из водного раствора.

В последние годы для разделения смесей пептидов очень широко применяется высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) на носителях с обращенной фазой (рис. 12), которые представляют собой силикагель с ковалентно присоединенными углеводородами, содержащими обычно 8 или 18 углеродных атомов. Используется также и просто хроматография на силикагеле. Разделение проводится с помощью специального жидкостного хроматографа, в комплект которого входят: колонки, особым образом упакованные, насос, позволяющий создавать давление до 200 атм, градиентный смеситель, работающий с высокой степенью воспроизводимости, и высокочувствительный ультрафиолетовый или флуоресцентный детектор (рис. 13). К достоинствам метода следует отнести исключительно высокую скорость разделения (менее 1 ч), воспроизводимость результатов и возможность проводить аналитические опыты на микрограммовых количествах вещества. Особенно эффективно применение ВЭЖХ для разделения смесей низкомолекулярных пептидоа, образующихся при ферментативном расщеплении белков. Хроматография обычно проводится на колонках с обращенной фазой С|Л в 0,05%-ной трифторуксусной кислоте с исполь-

зованием для элюирования градиента ацетонитрила Разрешающая способность таких носителей превосходит разрешающую способность ионообменных смол. С помощью ВЭЖХ в ряде случаев удается разделить смеси высокомолекулярных пептидоа и белков.

55

Строение белков и пептидов

Аналитический контроль за процессом разделения высокомолекулярных пептидов осуществляется с помощью электрофореза в пол ивк рилами дном геле. Электрофорез проводится в присутствии д о деци л сульфата натрия, который образует мицеллы с разделяемым веществом, нивелируя его электрический заряд, в результате чего разделение происходит исключительно по молекулярной массе. Метод имеет большую чувствительность и высокую разрешающую способность. Электрофорез используют н для непосредственного разделения небольших количеств пептидов.

Часто перед исследователями встает задача селективного выделения из суммарного гидролизата белка пептидов несущих определенные функциональные группы. Для этих целей может быть эффективно использована хемоспецифическая, или ковалеитная хроматография, основанная на образовании ко валентной связи пептида с носителем. Чаще всего метод ковалентной хроматографии применяют для селективного выделения цистеинсодержащих пептидов. В основу метода положена иммобилизация пептидов, содержащих свободные сульфгидрильные группы, на носителях с активированными SH группами за счет реакции тиол дисульфидного обмена, в результате которой между пептидом и носителем образуется дисульфидная связь (рис. 14). При этом пептиды, не содержащие остатков цистеина, не связываются с носителем и удаляются при промывании соответствующим буфером. Цистеинсодержвщие пептиды выделяют далее восстановлением дисульфид ных связей при рН 8,0 избытком меркаптоэтвнолв или дитиотреитв. Более селективного разделения тиолсодержвщих и тиолнесодержащих пептидов можно достигнуть, если проводить ферментативный или химический гидролиз белка, предварительно иммобилизованного иа нерастворимом носителе. В квчестве носителя в обоих случаях используется тиол сефароэа 4В, которая содержит в качестве активированной группы смешенный дисульфид, обрвзующийся при обрвботке глу-твтион-сефврозы 2,2' дипиридилдисульфидом

СООН I

СН,

I

NH I

с=о

I

-СН —С—NH—СН—СН..

\

С- N—СН—CHj

соон

Тиол-сефвроэв

< <

Сильно гидрофоб ные пептиды

Менее гидрофоб • ные пептиды

Гидрофильные ф пептиды

Объем элюента Сипикагель

Гидро-фобн1

Г идрофооная чв. участон оболочка ж пептида

Значительно большей химической устойчивостью облвдвют мвтрицы ив неорганической основе — пористое стекло, кремнезем. Тек, не активированном тиол-кремнеземе можно проводить иммобилиза-

?

Рис. 12. Разделение пептидов хроматографией на обращенной фазе.

56

Белки и пептиды

—О—Si—(СН2)»—NH—СО—CHi-

Тио л -к рем и в эв м

цию труднорастноримых (мембранных) белков и осуществлять последующий химический гидролиз конъюгата

Рис. 13. Жидкостной микроколоночный хроматограф «Миллихром» (СССР, по «Научприбор», г. Орел).

(Ту,

W

X ^^Промывка

0-

Ж Смесь п< J (Франц.

пептидов (франция!)

<

Цислвимсодержащмй фрагмент (франция II)

Рис. 14. Разделение тиолсодерлсащих и гнолнесодержащих пептидов ковалент-ной хроматографией.

Существуют также методы ковалентиого присоединения к носи телям триптофан- и лизинсодержащих пептидов, однако они применяются относительно редко.

Для селективного выделения пептидов можно использовать иммуносорбеиты, представляющие собой антитела, ковалентно присоединенные к нерастворимому полимеру-носителю- Среди последних нашли распространение носители на основе производных бром-ацетил целлюлозы и гелей агарозы с ковалентно присоединенными антителами к 2,4-динитрофенолу. Такие носители применяются для выделения функционально важных пептидных фрагментов, содержащих реакционноспособные аминокислотные остатки после их селективного динитрофеиилирования. Разработаны методики присоединения 2 4 динитрофенилыюй группы к остаткам цистеина, метионина, лизииа и триптофана.

Новые возможности для специфичного выделения отдельных фрагментов белка открылись а связи с разработкой техники моно-клональных антител (рис. 15). Иммуиосорбенты на основе монокло-нальных антител к различным участкам белковой молекулы могут быть использованы для селективного выделения пептидных фрагментов, несущих антигенные детерминанты этих внтител. Поскольку в основном антигенные детерминанты находятся во фрагментах полипептидной цепи, располагающихся на поверхности глобулы, метод применяется также для изучения топографии белков.

Определение аминокислотной последовательности

57

Строение белков и пептидов

Для установления аминокислотной последовательности белкоа используется совокупность химических, ферментативных и физико-химических методоа. Ниже будут рассмотрены те из них, которые иашли наиболее широкое применение в практике структурной химии белка.

Метод Эдмана. Основным методом определения аминокислотной последовательности является метод деградации полипептидной цепи с помощью фенилизотиоцианата (ФИТЦ), разработанный П. Эдма-ном в 1950 — 1956 гг. Метод Эдмана позволяет последовательно отщеплять N-концевые аминокислотные остатки а виде фенил тиогидантоинов (ФТГ). Каждый цикл деградации включает три стадии: 1) образование фенилтиокарбамоил (ФТК) -пептида, 2) отщепление N-концевого остатка аминокислоты в форме анили-нотиазолинона, 3) изомеризацию тиазолинона в ФТГ и идентификацию последнего.

R'—С:Н—С—NH—?н—

т*

N — Н

фитц

R'—СН —С=0 *Н N—СеН

V II

S

ОН

,-с_,

Т- т

NH „

он

с„н,

сн—с—NH—сн—со— "*».

S.

43?

с

I

ФТН пептид

< ^-он н Ч

OH R

I + I

R —СН—С—NHj—СН—СО—

йн •

Г

1+

NH к ¦+

I

NH—С6Н5

+ I

HaN—СИ—СО----

3 - фенил - 2-тиогидантоин

ФТН аминонислота

2-анилин о - 5-тиаэолинон

На первой стадии происходит присоединение ФИТЦ к непротони-рованной а-амииогруппе пептида.

Реакция проводится в летучих буферных системах (рН 9,0 — 9,5); в качестве оснований используются третичные или гетероциклические амины (триэтнламнн, диметилаллнламин, пиридин). Выкод на этой стадии может существенно снижаться вследствие побочных реакций. Такими реакциями являются окислительное десуль-фирование ФТК-группы пептида под действием кислорода воздуха, блокирование гх-аминогруппы пептида за счет образования оснований Шиффа со следовыми количествами альдегидов, присутствующих в реагентах и растворителях Поэтому все стадии деградации пептида по методу Эдмана проводятся в атмосфере инертного газа, а употребляемые реагенты предварительно тщательно очищаются. В щелочных условиях ФИТЦ гидролнзуется с образованием дифенилтиомочевнны и анилина. Побочные продукты затрудняют идентификацию феннлтиогидантоинов аминокислот, поэтому после стадии присоединения производится экстракция реакционной смеси бензолом для удаления остатков ФИТЦ и побочных продуктов.

58 На второй стадии деградации в присутствии безводной сильной

- кислоты (обычно трифторуксусной) происходит отщепление N-koh-

Белки и пептиды цеаой аминокислоты с образованием 2 аннлино 5 тиазо инона и

освобождение а-аминогруппы последующего аминокислотного

остатка.

Условия раакции достаточно мягкие и обычно не вызывают неспецнфнче-ского расщепления по ипептидной цепи. Однако остатки глутамина, когда они становятся N концевыми в пептиде, могут превращаться в остатки пнроглутамн-новой кислоты, блокирующие дальнейшую деградацию.

с—сн,

H2N—СН— С=0

СНз—CHj

о=с |

NH—СН—С=0

Специфичный комплекс ^4*Ag моноклонального антитепа с

антигенной детерминантом пептида

Рис. 15. Разделение пептидов аффинной хроматографией на иммуносорбенте.

Аспарагин в кислых условиях (особенно в случае последовательности Asn — Gly) может образовывать циклический имнд (см. с. 51), также препятствующий процессу.

Стадия изомеризации состоит из двух последовательных реакций — быстрый гидролиз тиазолинона в ФТК произаодное аминокислоты и циклизация последнего в З-фенил-2-тиогидантоин.

Некоторые ФТГ частично разрушаются в условиях изомеризации (1 н. HCI ВО "С. 10 мин). Так, ФТГ серина легко отщепляет молекулу воды, в меньшей степени процесс деградации протекает и у треонина. Для предотвращения разрушения ФТГ изомеризация иногда проводится в л ри l утствн и различных тиолов (ди иозритри i бутандитиол и др.).

Идентификация отщепленных ФТГ является определяющей стадией в процессе деградации пептидов по методу Эдмана. В течение длительного времени для этой цели использовалась хроматография на бумаге, однако затем она была вытеснена другими более чувствительными и скоростными методами: микротонкослойной хроматографией на силикаге е и полиамиде, жидкостной и газожидкостной хроматографией.

Для одномерной и двумерной микротонкослойной хроматографии разработан ряд систем растворителей. Способ обнаружения ФТГ основан на сильном поглощении jthx производных в УФ области спектра (>.и„с = 265 — 270 нм. среднее значение молярного коэффициента экстиикции равно 16 000). В состав сорбента на п а инк х доЬавля я флуоресцентный индикатор. Чувствительность метода состав.1 нет I нмоль вещества.

Жидкостная и газожидкостная хроматография для идентификации ФТГ обычно 59

используется в комбинации с автоматической деградацией пептидов на сек вена торе__

(см. ниже). При газожидкостной хроматографии ФТГ после перевода в летучее р Л«п

состояние разделяются на специальных колонках, наполненных жидкой фазой р е и Ое КОВ и пептидов

(обычно смесь силиконовых фаз). Некоторые ФТГ перед хроматографировани м необходимо силилировать, чтобы повысить их летучесть (Asp, Glu, CMCys, CysS03H) или улучшить разделение (Ser, Thr. Lys). Поэтому анализ обычно проводится в две приема (до и после силилировання).

В последние годы наиболее широкое применение для идентификации ФТГ находит жидкостная хроматография высокою разрешения на колонках с обращенной фазой. Хроматография проаодится

60

Белки и пептиды

Эдмвн (Edman) П»р Виктор

(1916—1977), шведский химик. Окончил Каролинский институт ¦ Стокгольме (1946); с 1957 г.— руководитель отдела молекулярной биологии в Институте медицинских исследований в Мельбурне (Австралия) и с 1971 г.— в Институте биохимии Общества М. Планна в Мартинсриде (ФРГ). Автор широко известного метода определения первичной структуры пептидов и белков. Совместно с Дж. Бэгом разработал конструкцию прибора для автоматического определения аминокислотной последовательности.

^ООООс°°н

| ДНС [-CI

Jjl»[flfic^g)

I стадия деградации по методу Эдмана

I '

h2n-QQOcooh

[ДНГГ|-С1

-[ДНС

II стадия деградации по методу Эдмана

НгМООсоон

| ДНС [-CI

ДНСКРго

II стадия деградации по методу Эдмана

h2n-(^)-cooh I | дне |-ci

^>[днс>@

Г AlaYPheYProV He

Рис. 17. Определение аминокислотной последовательности пептида методом ДНС Эдмана.

либо в градиенте концентрации ацетонитрила или метанола 61

(рис. 16), либо в изократиых условиях (в отсутствие градиента). -

Достоинствами метода являются: высокая чувствительность (30 — Строение белков и пептидов

50 пмоль), скорость (на один анализ требуется менее 10 мин), хорошая разрешающая способность и возможность количественного определения ФТГ. Часто для идентификации аминокислот, отщепляемых при деградации пептидов по методу Эдмана, используются также масс-спектрометрия и аминокислотный анализ. В по следнем случае анализируемый ФТГ вначале гидролизуется с помощью HI до свободной аминокислоты.

Среди модификаций метода Эдмана широкое применение нашел метод, сочетающий последовательную деградацию пептида с анализом N-концевых аминокислотных остатков в виде их да не ильных производных (ДНС-Эдман). По этому методу перед каждым циклом деградации отбирается определенная» аликвотная часть пептида для анализа N-концевой аминокислоты (рис. 17). Достоинства метода — более высокая чувствительность определения ДНС-вминокислот и меньшие потери материала на каждой стадии деградации за счет исключения экстракции бензолом ФТК-производных пептидов. Ограниченная доступность биологического материала вызывает необходимость работы с субмикроколичествами белков и ^^^^^^^^^^^^^^^^ побуждает к поиску новых методов структурного анализа. Суще- сн

ствует большое число аналогов ФИТЦ, которые образуют тиоги- 4n—^~^V-n__N-fi~s

дан пины обладающие рядом преи

страница 9
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.10.2017)