Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

ие к образованию трансмембранного ионного канала. Холинорецепторы подразделяются на два типа: никотиновые и м с кари новые Никотиновые рецепторы способны активироваться никотином и находятся в основном в месте контакта аксонов со скелетными мышцами, в то время как м с риновы рецепторы имеют высокое сродство к мускарииу и сосредоточены в мозге, секреторных клетках, гладких и сердечных мышцах (см. с. 770).

Связывание ацетилхолина с мускариновыми рецепторами сопровождается увеличением концентрации циклических нуклеотидов, а взаимодействие с никотиновыми рецепторами приводит к открытию ионных каналов и соответственно изменению ионной проницаемости постсинаптической мембраны. Как следствие происходит деполяризация клеточной мембраны за счет быстрого входа ионов натрия, что в конечном итоге ведет к возбуждению мышечной клетки. Следовательно, биологическая функция никотинового ацетил холинового рецептора заключается в изменении ионной проницаемости постсинаптической мембраны в ответ на связывание ацетилхолина. После этого ацетилхолин гидролизуется ацетилхолинэсте-разой до холина и рецептор переходит в исходное состояние.

Ацетилхолиновый рецептор локализован в зоне синаптических кон вктов с очень высокой плотностью, превышающей 1 молекулу рецептора на 100 нм2 поверхности мембраны. Такая плотность позволяет секретируемым молекулам ацетилхолина вступать во взаимодействие с рецептором, избежав гидролиза ацетилхолин-эстеразой.

Наиболее богатым источником ацетилхолинового рецептора ни коти нового типа являются электрические орга ны (электро-

плаксы) скатов Torpedo marmorata или Torpedo californica, в которых на 1 кг ткаии приходится около 100 мг рецептора (для сравнения следует отметить, что в скелетных мышцах млекопитающих холинорецептора примерно в 600 раз меньше). Мембранные препараты электроплаксов на 25—30% состоят из рецептора. Впервые ацети хо и новый рецептор был выделен в начале 70-х годов с помощью полипептидных нейротоксинов из яда змей. Такие нейро токсины, например а-бунгаро токсин из яда к раита Bungarus multi cinctus (см. с. 281), способны селективно и практически необратимо связываться с холи но рецептором, что позволяет их использовать в процессе его выделения для идентификации и приготовления аффинных сорбентов. Значительный вклад в исследование холи но рецепторов внесли лаборатории Ж.-П. Шанже (Франция) и М. А. Рафтери (США), где было осуществлено их выделение, определение субъединичного состава и установление частичной аминокислотной последовательности компонентов.

Ацетилхолиновый рецептор электроплаксов является олигомер-ным белком, состоящим из четырех субъединиц с предполагаемыми молекулярными массами ~ 40 000, 48 000, 58 000 и 65 000, которые называются соответственно a-, (J-, у- и 6-субъединицами и присутствуют в молярном соотношении 2:1:1:1. Участки связывания ацетилхолина рвсположеиы на ct-субъединицах, и с одной молекулой рецептора одновременно могут связаться две молекулы нейромедиатора. Все субъединицы белка гликозилированы: из общей молекулярной массы рецептора 285 000—290 000 около 20 000 приходится на углеводные остатки. В мембране электроплаксов ската рецептор в основном находится в димерной форме, образованной за счет дисульфиднои связи между 6-субъединицами, причем по функциональной активности мономериая и ди мерная формы практически не отличаются. Ацетилхолиновый рецептор связан с белком молекулярной массы 43 000, с помощью которого ои закрепляется в цитоскелете постсинаптической мембраны.

Холинорецептор является кислым гликопротеином со значением pi 4,5—4,8. Для него характерно высокое содержание остатков дикарбоновых аминокислот. По данным аминокислотного анализа в нем обнаружено присутствие остатков фосфотреонина и фосфо-серина. Следовательно, субъединицы рецептора способны фосфори-лироваться, однако физиологическая роль этого процесса остается пока неизвестной.

Первоначально были установлены полные аминокислотные последовательности всех субъединиц рецептора ацетилхолина из электрического органа ската Torpedo. Работы по структурному анализу холинорецептора методами молекулярной генетики проводились Э. Барнардом (Англия) и Д. М. Патриком (США), а основная часть исследования осуществлена в лаборатории Ш. Нумы (Япония). Поскольку около 2,4% суммарной информационной РНК электроплаксов ската кодирует компоненты рецептора, в библиотеке кДНК удалось достаточно быстро идентифицировать клоны, содержащие структурные гены всех субъединиц. При анализе структуры этих генов было выяснено, что а-субъединица построена из 437, р" из 469, у из 489 и 6 из 498 аминокислотных остатков (соответствующие молекулярные массы 50 116, 53 681, 56 601 и 57 565). Трансляция каждой субъединицы осуществляется отдельной мРНК, и для всех субъединиц характерно наличие гидрофобных сигнальных пептидов, состоящих из 17—24 аминокислотных остатков. Оказалось, что субъединицы рецептора обладают высокой степенью структурной гомологии и, по-видимому, их гены образовались в процессе эволюции из одного гена-предшествениикв.

Аминокислотная последовательность субъединиц холинорецептора определена также на основании исследования соответствую-

629

Характеристика отдельных биологических мембранных систем

Шанже |Changeux| Жан Пьер (р. 1936), французский биохимик. Окончил Парижский университет (1958), с 1975 г.— профессор Пастеровского института и Коллеж де Франс. Предложил (1965, совместно с Ж. Моно и Дж. Уаймв-ном) гипотезу аллостерической регуляции ферментов, впервые выделил, очистил и охарактеризовал ацетилхолиновый рецептор.

630

Биологические мембраны

Барнард |Barnard| Эрни (р. 1927), английский биохимик, работающий в области мол кулярнои неиробиологии. Образование получил б Королевском колледже в Лондоне, в настоящее время— руководитель отдела неиробиологии Медицинского исследовательского совета в Кембридже. Основные работы — го исследованию мембранных реце торов. Одним из первых установил структуру (-субъединицы ацетилхоли-нового рецептора (1982).

щих генов человека, теленка, цыпленка и др. Так, в геномном банке цыпленка при гибридизации с кДНК у-субъединицы из электроплак-сов обнаружен фрагмент ДНК, состоящий из 9000 нуклеотидов и кодирующий у- и о субъединицы холинорецептора. Гены этих субъединиц содержат по 12 экзонов, характеризуются аналогичной структурой и локализованы в геноме в непосредственной близости друг от друга, а Субъединицы ацетилхоли нового рецептора человека и теленка состоят также из 437 аминокислотных остатков и обладают соответственно 81% и 80% структурного сходства с а-субъединицей из электроплаксов Torpedo. В целом структура компонентов холинорецептора весьма консервативна и сходна для всех исследованных животных. При анализе кДНК мышцы теленка было обнаружено существование нового компонента рецептора — е-субъединицы, обладающей более 50% структурной гомологии с у-субъединицами рецепторов человека, теленка и электрического ската.

Первоначально иа основании анализа профиля гидрофобное™ полнпептидиых цепей холинорецептора было предположено, что каждая субъединица имеет по четыре трансмембранных фрагмента, в N- и С-концевые участки белков расположены снаружи постсинаптической мембраны. Однако с помощью антител против синтетических пептидов, соответствующих С-концевым областям различных субъединиц, удалось доказать локализацию С-кониевого фрагмента на цитоплазматической стороне мембраны, вследствие чего убъединицы холинорецептора должны име ь по крайней мере по пять трансмембранных сегментов.

При трвнеляции мРНК, кодирующих субъединицы холинорецептора, in vitro в бесклеточной системе наблюдалось образование белков, соответствующих по размерам компонентам рецептора, но в этих условиях не были обнаружены ни специфичное связывание а-нейротоксинов из яда змей, ни самосборка субъединиц в пента мерный рецепторный комплекс. Трансляцию функционально активных холинорецепторов удалось провести в ооцитах лягушки Хепо-pus. Инъекция в ооииты суммарной мРНК электроплаксов или смеси мРНК, соответствующих четырем субъединицам, приводит к образованию рецепторного комплекса, который не только специфично связывает а-бунгаротоксин, но и изменяет ионную проводимость клеточной мембраны под действием ацетилхолина, либо его агоиистов; это использовалось для изучении функциональной роли отдельных субъединиц.

Дальнейшие исследования были направлены на получение в ооцитах гибридного холинорецептора. Рецептор, построенный из а-, р- и 6-субъединиц электроплаксов Torpedo и у-субъединицы мышцы теленка, обладал функциональной активностью, при этом замена 6-субъединицы на соответствующий компонент из мышцы теленка заметно изменяла воротные свойства, не влияя на проводимость канала ацетилхоли нового рецептора. С помощью метода направленного мутагенеза была установлена важная роль остатков Cys-192 и Cys-193 а-субъединицы холинорецептора Torpedo в связывании ацетилхолина, а также охарактеризованы отдельные остатки или фрагменты полипептидиой цепи, модификация или делеция которых приводит к блокированию ионного канала (Ш Нума).

Дифракционными методами были определены размеры молекулы ацетилхолинового рецептора и установлена его трансмембран-иая организация (рис. 340). На электронных микрофотографиях рецептор имеет вид розетки диаметром около 8,5 нм, в центральной части которой различают входное отверстие — 2 нм для трансмембранного канала. Предполагается, что этот канал образован фрагментами полипептидных цепей всех пяти еубъединиц. Наиболее

вероятное расположение субъединиц рецептора друг относительно друга — a-fi-a-v-6.

В электрофизиологических экспериментах установлены основные параметры одиночного канала холинорецептора: его проводимость составляет 20 пСм (См — сименс, единица измерения электропроводимости), а время жизни не превышает 1—3 мс. Канал проницаем для ионов натрия, калия, кальция и даже некоторых органических катионов. С учетом размера последних полагают, что канал представляет собой пору, размеры которой в самой узкой части должны быть не менее 0,65 0,65 нм.

631

Характеристика отдельных биологических мембранных систем

8 5нм

Рис. 340. Модель трансмембранной организации ацетил холи нового рецептора.

Согласно существующим моделям функционирования канала ацетилхолинового рецептора, рецептор может находиться в трех состояниях: покоя, открытом (активированном) и десенситизиро-ванном. Актиаация канала достигается взаимодействием с ацетил холином и является быстрым процессом, протекающим в милли секундном диапазоне. В десенситизированном состоянии медиатор все еще связан с рецептором, но канал уже закрыт. Переход из одного состояния в другое, по-видимому, сопровождается существенными конформацноиными изменениями субъединнц белкового комплекса. Таким образом, ацетилхолиновый рецептор никотинового типа представляет собой трансмембранный комплекс пяти лихо протеи но в, образующий хемо возбудимый ионный квнал. В отсутствие ацетилхолина канал находится в закрытом состоянии. При связывании с ацетилхолином канал на короткое время открывается для прохождения через него ионов натрия и калия, а затем переходит а десенситизированное состояние.

632

Натриевый канал

Биологические мембраны

При генерации и проведении нервного импульса первоначальное изменение мембранного потенциала нервного волокна осуществляется за счет повышения проницаемости мембраны для ионов натрия. Этот процесс связан с функционированием быстрых натриевых каналов, управляемых мембранным потенциалом. Еще в начале 50-х годов А. Л. Ходжкии и Э. Ф. Хаксли детально изучили изменение мембранной проницаемости аксонального волокна и предложили теорию функционирования ионных каналов, являющихся, в отличие от хемовозбудимых ацетил холи новых каналов, типичными представителями электровозбудимых мембранных транспортных систем. Прн прохождении нервного импульса происходит некоторое снижение мембранного потенциала нерва, что оказывается достаточным для изменения конформацни белковых компонентов натриевого канала и перехода его в открытое состояние. Ионы натрия входят внутрь волокна и вызывают деполяризацию мембраны, которая, а свою очередь, активирует находящиеся рядом каналы. Предполагается, что в составе натриевого канала существует два основных функциональных участка — ион проводящий фрагмент с селектианым фильтром и потенциал-чувствительный воротный механизм.

Максимальная концентрация натриевых каиалоа обнаружена в области перехватов Ранвье нервных волокон, где их плотность достигает 2 на 100 нм поверхности мембраны; примерно в 100 раз меньшее количество их находится в тканях мозга и мышц. Исследование этих транспортных систем в основном осуществлялось электрофизиологическими методами, а также с помощью нейро-токсинов.

Природные нейротоксины можно использовать в качестве своеобразных инструментов, позволяющих селективно воздействовать на отдельные компоненты канала. В изучение молекулярной организации натриевых каналов как рецепторов нейротоксинов значительный вклад внесли исследования В. А. Катералла (США), М. Лаздунского (Франция), Е. В. Гришина (СССР).

Существуют по крайней мере четыре группы нейротоксинов. по-разному влияющих на работу натриевых каналов. Тетродотоксин и сакситоксин (см. с. 763, 771) селективно блокируют транс мембранный ток ионов натрия и, по-видимому, связываются с ион-про водя щей частью канала. Батрахотоксин. аконитин и вера рицин влияют на активацию натриевых каналов и, по всей видимости, также взаимодействуют с компонентами, осуществляющими транспорт ионов натрия. Полипеггтидиыс токсины скорпионов (см. с. 2ЯЗ) н морских анемон (см. с. 284) замедляют инактивацию, а некоторые нейротоксины из яда американских скорпионов воздействуют на процесс активации натриевых каналов. Наиболее вероятно, что их рецепторы входят в состав воротного механизма мембранной системы транспорта ионов натрия.

Натриевые каналы были впервые выделены М. А. Рафтерн из электрических органов угря Electrophone electncus Установлено, что они представляют собой гликопротеины молекулярной массы около 260 000, в которых —30% приходится на углеводные компоненты. Детекция каналов в процессе выделения осуществлялась с помощью радиоактивных производных тетродотоксина или сакси-токсина. В других тканях натриевые каналы содержат несколько компонентов. Например, в мозге крысы они образуют олигомерный комплекс из трех гликопротеинов молекулярной массы 260 000 (сх) 39 000 (р\) и 37 000 (fij). Все субъединицы характеризуются высокой степенью гликозилирования и наличием большого числа остатков дикарбоиовых аминокислот. Выделенные препараты каналов из различных электровозбудимых тканей удалось реконструировать

в искусственных мембранах с восстановлением практически полной функциональной активности, присущей натриевым каналам электровозбудимых мембран.

Аминокислотная последовательность белка натриеаого канала из электрического органа угря была определена в лаборатории Ш. Нумы при анализе кДНК, полученной с использованием мРНК электроплаксов. Идентификация клонов в библиотеке кДНК

633

Характеристика отдельных биологических мембр

страница 84
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.09.2017)