Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

структурную организацию: Fi состоит из 5 типов субъединиц, обозначаемых гх, р\ у, ft. у а порядке уменьшения их молекулярной массы, a F-. из трех — а, Ь, с. До сих пор нет общепринятого мнения о стехиометрии субъединиц F» - Fu-комплекса, однако для бактериальных ферментов большинство данных свидетельствует в пользу соотношений аф.уое для Fi и aib»Cr к для Fn.

Современные представления о функциональной роли субъединиц Н ' -АТФазы, в частности субъединиц Fi, сформировались главным образом на базе данных, полученных Я. Кагавой, кото рый показал, что каталитический центр фермента локализован в р*-субъединице, а в а — находится центр связывания ADP. которому приписывается роль аллостерического регулятора. Комплекс yfif взаимодействует с Fd, блокируя его протонную проводимость. На основании этих результатов Я. Кагава предположил, что в состав молекулы Н 1 -АТФазы входят три функциональных компонента: энергетический трансформер (афч)« «ворота» (y*V) и протонный канал (F ) Канальная часть непосредственно взаимо действует с воротами, переход которых из закрытого в открытое состояние управляется либо разностью электрохимического потенциала протоноа на мембране, либо гидролизом АТР в транс -формере.

В отличие от каталитической части, функциональная роль субъединиц F исследована гораздо хуже. Наиболее изученной является субъединица с. Именно этот белок является мишенью для DCC, поэтому его обычно называют DCC связывающим белком, а из-за его растворимости в органических растворителях — протеолипидом; в настоящее время ни у кого не вызывает сомнения тот факт, что он непосредственно вовлечен в процесс трансмембранного переноса протонов. Субъединица Ь, возможно, формирует на мембране центр связывания F и, вероятно, совместно с протеолипидом участвует в образовании протон проводящею пути в сопрягающей мембране. Функциональная роль третьей субъединицы F остается пока невыясненной.

Ф. Гиб*, о ном было показано, что гены, кодирующие субъединицы Н -АТФ<мы Е coli, образуют unc-оперон (иногда назы-

вают а(р-опероном), нуклеотидная последовательность которого была установлена благодаря работам Д. Уолкера, М. Футаи и их сотр. (рис. 335).

На основании нуклеотидной последовательности кДНК соответствующих мРНК структурных генов unc-оперона были определены аминокислотные последовательности всех субъединиц Н ь-АТФазы Е. coli. Подобным же методом установлена первичная структура субъединиц Н ь-АТФазы термофильных бвктерий PS-3. В случае Н н-АТФаз митохондрий и хлоропластов информации об аминокислотной последовательности была получена в основном с помощью методов классической белковой химии. Н 1 -АТФаза митохондрий имеет более сложное субъединичное строение, чем соответствующие ферменты бактерий и хлоропластов. Установление первичной структуры субъединиц митохондриального фермента (Д. Уолкер, Ю. А. Овчинников, Л. Эристер и др.) позволило осуществить сравнительный анализ первичных структур субъединиц Н~ -АТФаз из различных источников с использованием компьютерных программ. На основании полученных данных был сделан вывод, что субъединицы, выполняющие важную функциональную роль в комплексе, например формирующие каталитический центр фермента (а, р") или составляющие основу мембранного сектора (а, с), имеют в значительной степени более консервативную аминокислотную последовательность, вероятно, и более консервативную пространственную организацию в Fi - Fn- комплексе, чем субъединицы, принимающие участие во взаимодействии квталитической (F,) и протон-проводнщей (F ) частей комплекса, а также в регуляции его АТФазной или АТФ-синтезирующей активностей.

621

Характеристика отдельных биологических мембранных систем

Квгава ]Kagawa) Ясуо (р. 1932), японский биохимик Окончил Токийский университет (1957), с 1972 г.— профессор биохимии медицинской школы Дзити. Известен работами области изучения структуры мембранных белков, прежде всего белков, выделенных из мембран термофильным бактерий.

Число аминокислотных остатков

Молекулярная месса

ь

156

Fi

Ь

177

30267 17212 8250 33264 50157 31410 19310 14194

Рис. 335. Схема строения unc-оперона Е. coli.

Na К -Активируемая вденозинтрифосфатаза. Характерной особенностью животных клеток является резко выраженная асимметрия их ионного состава относительно внешней среды. Так, внутриклеточная концентрация ионов калия примерно в 30 раз выше, а ионов натрия в 10 раз ниже, чем в окружающей среде. Градиенты концентрации ионов натрия и калия регулируют объем клетки и ионный состав в узких пределах колебаний, обеспечивают электрическую возбудимость нервных и мышечных клеток и служат движущей силой для транспорта в клетку Сахаров и аминокислот. Трансмембранные градиенты концентраций катионов являются

результатом функционировании Na + ,К 4-активируемой аденозин-трисросфатазы плазматических мембран. Это одно из самых «энергоемких производств» клетки, потребляющее до 40% производимого АТР.

Боже ста лет назад Ю. Либих установил, что в клетках содержится гораздо меньше натрия, чем во внеклеточной среде. С тех пор был накоплен большой экспериментальный материал, свидетельствующий о неравновесном распределении катионов между клеткой и средой. С появлением метода радиоактивных изотопов было обнаружено, что ионы натрия непрерывно проходят через мембрану в обоих направлениях, и возникло предположение о существовании «натриевого насоса» - особого мембранного энергозависимого механизма перекачки ионов натрия из клетки в окружающую среду (Р. Б. Дни, 1У41).

Многочисленные исследования процессов транспорта, проведенные в 50-х годах главным образом на аксонах головоногих моллюсков и «теиях» эритроцитов, выявили следующие основные характеристики «натриевого насоса». Активный выброс ионов натрия зависит от внеклеточной концентрации ионов калия, и, наоборот, внутриклеточное содержание Na4 управляет потоком К f в клетку, т. е. потоки Na *~ из клетки и К ' в клетку взаимосвязаны. Активный транспорт эиергозависим и возможен лишь при наличии в клетке АТР, т. е. иоииые потоки сопряжены с гидролизом АТР.

Na + ,К4 -Активируемая вденозинтриеросфатаза была открыта Й Скоу в 1957 г. Во фракции плазматических мембран нервов краба им была обнаружена Mg^-зависимая АТР-гидролизующая активность, функционирующая только при одновременном присутствии Na4 и К и ингибируемая кардиоактивными стероидами. И. Скоу предположил, что данная АТФаза обеспечивает энергией транспорт ионов натрия и калия против их градиентов.

Na4 ,К 1 -Активируемая АТФаза обнаружена во всех исследо-ьанных клетках животных. Особеиио велико ее содержание в opia-нах, осуществляющих интенсивный солевой обмен (почка, солевая железа) или выполняющих электрическую работу (нерв, мозг, электрический орган). Разработаны методы получения высокоочищен-ных препаратов Na + ,K -АТФазы. В настоящее время наиболее широко используется метод П. йоргенсена (1974), заключающийся в избирательном удалении из плазматических мембран (с помощью низких концентраций додецилсульфата натрия в присутствии АТР) всех белковых компонентов, за исключением Na' ,К "-АТФазы, остающейся в мембранном матриксе и полностью сохраняющей функциональную активность. Гомогенный фермент состоит из двух полипептидных цепей с молекулярными массами 112000 (каталитическая субъедииица а) и 45 000 (гликозилированная субъединица fi) В опытах по реконструкции очищенного фермента в протеолипосомы Л. Хокиным в 1975 г. было прямо показано, что Na ^ К 1 - АТФаза является не просто энергопреобразующей частью «Na-насоса», но сама осуществляет активный транспорт Na+ и К г. сопряженный с гидролизом АТР, т. е. представляет собой «натриевый насос».

Активный транспорт одновалентных катионов, сопряженный с гидролизом АТР, является сложным многостадийным процессом, детальный механизм которого на молекулярном уровне еще не выявлен. В оптимальных условиях функционирования Na + ,K + -АТФазы при гидролизе одной молекулы АТР происходит перенос двух ионов калия внутрь клетки и трех ионов натрия в противоположном направлении.

Пониманию того, как функционирует Na , К +-АТФаза, способствовало детальное структурное исследование фермента, осуществ-

ленное в 1985—1986 гг. Большая сс-субъединица (~ 112000) фор мирует каталитически активный центр, осуществляющий гидролиз АТР и расположенный на цитоплазматической стороне мембраны, а также участвует в создании участка связывания кардиоактивных стероидов на наружной стороне мембраны. Таким образом, полипептидная цепь а-субъединицы пронизывает насквозь липидный бислой. Меньшая, гликозилированная \\ субъединица (— 45 ООО) локализована главным образом на наружной стороне мембраны, где она участвует во взаимодействии с кардиоактивными стероидами и где расположены ее углеводные цепи.

В состав молекулы фермента а- и р-субъединицы входят в экви-молярных количествах. Протомер оф (~- 155 000) является, таким образом, практически минимальной структурной единицей Na+,K4 -АТФазы.

Общие представления о пространственном строении молекулы Na + ,KJ -АТФазы были получены с помощью различных подходов. На основании результатов электронно-микроскопических исследований двумерных кристаллов белка была построена трехмерная модель Na 1 ,К 1 -АТФазы с разрешением 2 нм. В очищенном препарате фермента, представляющем собой фрагменты плазматической мембраны, молекулы белка (в концентрации до I г/мл) плотно упакованы в липидном бислое. В результате длительного ингибирования этих препаратов при пониженной температуре в присутствии иоиов Mg"> + ,K+ и ва на дата происходит ассоциация молекул фермента и формируется область даумерной кристаллизации. Элементарная ячейка этих кристаллов включает два протомера оф Результаты трехмерной реконструкции независимых наклонных серий изображений негативно окрашенных кристаллов показаны на рисунке 336 (Ю А. Овчинников, В. В. Демин, 1985). Вертикальные размеры модели (—11 нм) значительно больше толщины липидного бислоя, что также свидетельствует о внемембранном расположении основной части молекулы Na+, К ь-АТФазы.

В 1985 г. были определены полные первичные структуры каталитических а-субъединиц Na 1, К -АТФаз из электрического органа ската (Ш Нума), свиных почек (Ю. А. Овчинников) н почек овцы (А. Шварц). Чуть позднее были расшифрованы аминокислотные последовательности р-субъединиц фермента из двух первых источников. Во всех этих исследованиях использованы главным образом методы анализа нуклеотидных последовательностей, соответствующих их структурным генам. Детекция мРНК в процессе выделения и скрининг библиотек клонов осуществлялись с помощью специфических олигонуклеотидных зондов. Структурная информация, необходимая для синтеза этих олигонуклеотидов, была получена из аминокислотной последовательности пептидных фрагментов белка. Остановимся подробнее на анализе первичной структуры Na + ,K+-АТФазы почек свиньи. Как уже упоминалось, а-субъединица в составе нативного мембраиосвязанного фермента имеет большие гидрофильные участки, экспонированные на обеих сторонах мембраны, и более чувствительна к действию протеиназ по сравнению с гликозилированной р-субъединицей. В специально подобранных условиях удалось осуществить глубокое расщепление трипсином экспонированных участков а-субъединицы в составе нативной Na + , К -АТФазы (при полном сохранении интактности 0-субъеди-ницы). В результате была установлена структура большинства внемембранных фрагментов а-субъединицы, что в дальнейшем легло в основу модели пространственной организации ее полипептидной цепи.

В случае р-субъединицы для получения пептидов был осуществлен триптический гидролиз гомогенного белка, иммобилизованного на тиол-кремнеземе (см. с. 56).

623

Характеристика отдельных биологических мембранных систем

Скоу |Skou| Йене Кристиан (р. 1916). Детский биохимии. Окончил Копенгагенский университет (1944), с 1963 г.— профессор университета в Аарусе. Исследовал механизм действия местных анестетиков, что привело к открытию Na4, К+-ЛТФаэы (1957).

Рис. 336. Трехмерная модель Na + ,K'-АТФазы.

624

Биологические мембраны

Рис. 337. Аминокислотная последовательность сс-субьединицы Naf, К А ГФазы почек 1виньи.

Полные нуклеотидные последовательности кДНК, соответствующие транслируемым областям мРНК, и выведенные аминокислотные последовательности а- и р-субъединиц Na ', К ' - АТФазы почек свиньи приведены на рисунках 337 и 338 (Ю. А. Овчинников, Е. Д. Свердлов, Н. Н. Модянов). Полипептидная цепь а-субъединицы содержит 1016 аминокислотных остатков. Знание N-концевой последовательности белка позволило установить, что первичный продукт трансляции длиннее на 5 аминокислотных остатков, отщепляемых в ходе процессинга. Структура одного из триптических пептидов полностью совпадает с последовательностью, предшествующей терминирующему кодону (TAG). Аналогичная ситуация имеет место и в случае р-субъединицы. Таким образом, в С-концевых областях обеих субъединиц процессинг отсутствует. |1-Субъеди-ница состоит из 302 вминокислотных остатков. Инициирующий

1-15 AGGACCCGGCGCGGGACACAGACCACCGCCACT ATО «ев AAG CQQ GTT

(-S)-(-l) J4et Gly Lyi-Cly Val

16-90 GGA CCC GAT AAA TAT GAG CCC GCA GCC GTG TCA GAG CAT GGC GAC AAA AAG AAG GCC AAG AAG GAG AGG GAT ATG

1-25 Gly-ArB-A*p-I^s-Tyr-Clu-Pro-Ale-AU-VBl-Ser-Clu-Hi»-Gly-A*p-Ly»-Ly«-Lys-Ala-Lyi-Lyi-Glu-Are-A»p-Met-

91-166 GAT GAG CTG AAG AAC GAA CTT TCT ATG GAT GAC CAT AAA CTT AGC CTT GAT GAG CTT CAT CGC AAA TAC GGA ACG

26- SO A5p-Glu-Leu-Lys-Ly!-Clu-Val-5er-Met-A»p-Aip-lli5-Ly»-Leu-Ser-Leu-A*p-Glu-Leu-Hn-Arg-Lyi-Tyr-Cly-Thr-

166-240 GAC TTC AGC CGA GGC ТТА АСА CCT GCT CGA GCT GCT GAG АТС СТА GCC CGA GAC GGT CCC AAT GCC CTG АСА CCC

51- TS Asp-Leu-Ser-Arg- ly-Leu-Thr-Рго-Al -Arg-Ale-А]»-ГЛ u-1le-Leu Al -Arg A p Gly-Pro-Asn Al -Leu-Thr Pro-

241-315 CCA CCC АСА ACC CCT GAA TGG GTC AAG TTC TCT CGG CAG CTC TTC GGA CGC TTC TCC ATG TTA CTC TGG АТС GGA

76-100 Pro-Pro-Thr-Thr-Pro-Clu-Trp-Val-Lya-№e-Cy*-ArB-Gln-Leu-Phe-Cly-Gly-Phe-Ser-Met-Leu-Leu-TTp-Ilc-Cly-

316 390 GCG ATT CTT TGT TTC TTG GCC TAT GGC ATT CAA GCT GCT АСА GAA GAC GAA CCT CAA AAT GAT AAT CTG TAC CTT

101-125 Ala-lte-Uii-Cys-Phe-LBii-Ala-Tyr-Cly-Ile-Gln-Ala-Ala-Thr-Glu-Glu-Clu-Pro-Gln-Ain-Asp-Asn-LMi-Tyr-Lcii-

Э91-465 GGT CTG GTG CTC TCC GCC CTC GTC АТС ATA ACT GGC TGT TTC TCC TAC TAT CAA GAA GCG AAA AGC TCA AAG АТС

12b-ISO Cly-Val-Val-Leu-Ser-Ala-Val-Val-Ile-Ile-Thr-Gly-Cys-Ph -Ser-Tyr-Tyг-С 1n-CIu Ala Lys 5er-Ser Lys-lie-

466-540 ATG GAA TCC TTC AAA AAC АТС GTT CCT CAG CAA GCC CTC GTG ATT CGA AAT GGT GAA AAC ATG AGC ATA AAT GCA

151-175 Met-Clu-Ser Phe-Ly* Asn Met-Val-Pro-Cln-CIn-Ala-Leu-Val-lle-Arg-Aan-Gly-Glu-Lyi-Met-5«г-Ile-Asn-Ala-

541-615 GAG GAA GTC GTC GTC GGG GAT CTG GTG GAG GTG AAG GGA GGG GAT CGA АТС CCT CCT GAC CTC AGG АТС ATA TCT

176-200 G u-Clu-Val Val-Val-Gly-Asp-Leu-Va1-Glu-Vul-Ly*-Gly-Cly-Asp-Arg-Ile-Pro-Al*-Asp-Lao-Arg-1Vc-1le-Ser-

616-690 GCG AAC GCC TGC AAG GTG GAC AAC TCC TCC CTC ACT GCT GAA TCA GAA CCG CAG ACC AGG TCT CCA GAT TTC ACC

201-225 Ala-Asn-Cly-Cys-Lys-Val-Asr-Asn-Ser-Ser-Leu-Thr Cly-Clu-Ser-Clu РгО-Cln Thr-Arg Scr-Pro-Asp Phe Thr

591-765 AAT CAG AAC CCC

страница 82
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(19.10.2017)