Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

рии молекулярной биологии Медицинского исследовательского со-ета а Кембридже Основ ные работы посвящены рентгеноструктурному и электронно микроскопическому анализу структуры мембранных белков.

группы этот мембранный белок содержит эквимолекулярную смесь 13-цис- и полиостью гранс-ретиналя. Лип ид на я компонента пурпурной мембраны Н. halobium представлена диэфирным аналогом фосфатидилглицерофосфата (50%), сульфогликолипидами (30%), каротиноидамн и неполяриыми лнпидами.

Оказалось, что в галофильных микроорганизмах бактериородоп сии выполняет роль светозависнмого протонного насоса, создающего градиент ионов водорода; энергия этого градиента используется клеткой для синтеза АТР (рис. 328). Другими словами, фотосинтетическая машина галофильных бактерий представлена достаточно простой белковой системой, которая выполняет уникальную функцию «бесхлорофильного фотосинтеза».

Пурпурная мембрана представляет собой естественный двумерный кристалл. Молекулы бактериородопсина организованы в мембране в виде тримеров, причем каждый три мер окружен шестью другими так, что образуется правильная гексагональная решетка (рис. 329).

Это обстоятельство позволило применить прямые физические методы для изучения третичной структуры бактериородопсина в мембране. Комбинацией электронно микроскопических и дифракционных методов анализа была определена молекулярная структура белка в плане мембраны с разрешением в 0,37 нм, в то время как разрешение внутри мембранных участков полипептидиой цепи достигало всего лишь 1,4 нм. Полученная карта электронной плотности позволила выделить семь сегментов белковой молекулы, пронизывающих всю толщу мембраны в направлении, перпендикулярном ее плоскости. Р. Хендерсону удалось также установить, что каждый сегмент молекулы бактериородопсина находится в конформации а спирали

Выяснение первичной структуры бактериородопсина было завершено практически одновременно в 1979 г. в СССР Ю. А. Овчинниковым с сотр. и в США Г. Кора ной с сотр. Полипептидная цепь белка состоит из 248 аминокислотных остатков, 67% которых являются гидрофобными. Необходимо отметить, что бактериородопсин явился первым истинно мембранным белком, строение которого было полностью расшифровано.

Одним из главных препятствий при структурном изучении интегральных белков биологических мембран является их низкая растворимость. Мембранные белки практически нерастворимы в водных буферных системах, и это фактически исключает использование протеолитнческих ферментов в традиционной форме В процессе работы по установлению полной аминокислотной последовательности бактериородопсина применялись в основном химические методы расщепления полипептидной цепи, и образовавшиеся фрагменты разделялись на бногелях, уравновешенных концентрированным раствором муравьиной кислоты.

При изучении бактериородопсина были, по существу, впервые сформулированы принципы определения топо. рафии мембранных белков. Анализ распределения гидрофобных и гидрофильных аминокислотных остатков в полипептидной цепи позволяет сделать вывод о ее пространственной укладке в мембране. Гидрофобные зоны, по всей видимости, представляют собой трансмембранные сегменты, в то время как гидрофильные районы выступают из мембраны и соединяют отдельные внутрнмембранные а-спиральные тяжи белковой молекулы. Такого рода анализ выявил в первичной структуре бактериородопсина семь участков повышенной гидрофоб-ности, что хорошо согласуется с электронно-микроскопическими данными по топографии белка в мембране.

607

Характеристика отдельных биологических мембранных Систем

Остерхельт lOesterheltl Дитер (р. 1940), немецкий биохимик. Окончил Мюнхенский университет (1965), с 1979 г.— профессор Института биохимии Общества M. Планка в Мартинсриде. Основные работы посвящены биохимии, биоэнергетике и молекулярной биологии фоторецепторов, мембран и ферментов. Установил, что ре тин ал ьсо держащий белок Бактериородопсин функционирует как светочувствительный протонный насос (1972).

Рис. 329. Карта электронной плотности пурпурных мембран.

608

Биологические мембраны

Рис. 330. Топография бактериородопсина в мембране

Широкое применение нашел метод ограниченного протеолиза в изучении топографии бактериородопсина Так как молекула бакте риородопсина в пурпурной мембране обладает довольно жесткой упаковкой, можно было ожидать, что ее участки, расположенные внутри мембраны, окажутся недоступными для макромолекул фер ментов, в то время как области, экспонированные наружу, будут подвергаться ферментативному гидролизу. Ограниченный протеолиэ везикул с правильной и обращенной ориентацией бактериородопсина позволил локализовать N- и С концевые участки белка соответственно на наружной и цитоплазматической поверхностях мембраны.

При обработке пурпурных мембран протеиназами широкой спе цифичности, а частности папаином, было обнаружено четыре участка полипептидной цепн (рис. 330), выступающих на поверхность по обе стороны липидного бислоя.

Следует подчеркнуть, что бактернородопсин, расщепленный в различных положениях полипептидиой цепи и лишенный участков I—3, 66—72 и 232 -248, сохраняет в мембране специфическую укладку, определяющую его функционирование в качестве протонного насоса (В. П. Скулачев). Особо следует отметить тот факт, что как полиостью денатурированный бактернородопсин, так и фрагмен

ты ограниченного протеолиза химотрипсином способны в присутствии фосфолипидов и ретииаля давать реконструированный комплекс, активность которого практически не уступает активности нативного белка.

Весьма эффективным методом уточнения топографии мембранных белков, прежде всего точной локализации внемембранных участков, является использование моноклоиальных антител. Для получения гибридом использовались фрагменты бактериородопсина, полученные путем его расщепления протеолити чески ми ферментами. Наиболее ценными в этом случае оказались синтетические фрагменты: коррелируя величину синтетического пептида и эффективность связывания соответствующего антитела, можно с высокой степенью достоверности зондировать выступающие из мембраны полипептидные петли. Ниже показана локализация различных антигенных детерминант молекулы бактериородопсина в пурпурной мембране (Г. Корана, Н. Г. Абдулаев).

Как же бактериородопсин работает? В ответ на поглощение кванта света бактериородопсин вступает в цикл фотохимических превращений. При этом происходит обратимая изомеризация ре тиналя с последующим выбросом протона из молекулы белка и его

609

Характеристика отдельных биологических мембранных систем

05

_ присоединением со стороны цитоплазмы. Одна из спектральных

Биологические мембраны форм бактериородопсина с максимумом поглощения при 412 нм

(М 412) обладает депротонированнои альднминной связью между остатком ретииаля и белком.

Возможный механизм переноса протона через бактернородопсин предполагает наличие цепи водородных связей, образованной боковыми радикалами гидрофильных аминокислот и простирающейся через всю толщу белка. Векторный перенос протона через подобную цепь может осуществляться в том случае, если она состоит из двух участков и включает в себя функциональную группировку, способную под дейстаием света изменять свое микроокру жение и тем самым последовательно «замыкать» и «размыкать» эти участки. Альдимин ретиналя в молекуле бактериородопсина (при Lys-216) может вы цо л пять роль такого рода «челночного» механизма между двумя предполагаемыми белковыми проводниками протонов, один из которых сообщается с внешней, другой — с цитоплазматической поверхностью мембраны (рнс. 331).

В настоящее время природа протон-проводящего пути бактериородопсина интенсивно изучается в различных лабораториях. Одним из наиболее эффективных подходов в- этом направлении является использование методов белковой инженерии, суть которых состоит в замене одних аминокислот белка другими путем изменения соответствующих кодонов в гене с помощью направленного мутагенеза. В лаборатории Г. Кораны получено около 15 мутантных генов. Детальное исследование полученных таким образом белков с измененной аминокислотной последовательностью позволит ответить на вопрос о вовлеченности тех или иных аминокислот в общий механизм функционирования бактериородопсина Безусловно, важная информация будет получена из данных рентгеноструктуриого анализа по третичной структуре бактериородопсина с разрешением 0,25-^0,3 нм.

Рис. 331. Один из возможных механизмов переноса протона через молекулу бактериородопсина: R1 — R* — аминокислотные остатки, участвующие в образовании цепей водородных связей I и II;

Ml — светои ндуциро ванные превращения альдимина ретиналя.

Re / \

н н н

R8H—»-Н 4

N-C

— С J V

I

н

рН < рК R'-R°

V

п

РН > рК Re-R8

Зрительный родопсин

Характеристика

_ « _ . отдельных биологических

Родопсин — светочувствительный пигмент фоторецепторных *

клеток сетчатки глаза позвоночных — является а настоящее время

одним из наиболее изученных мембранных белков.

Существуют два типа фоторецепторных клеток — палочки (а) и колбочки (б).

Эти клетки состоят из двух основных частей: наружного сегмента — места непосредственной локализации фоторецепторных мембран и внутреннего сегмента, где осуществляется биосинтез белкоа и локализован аппарат энергообеспечения клетки. В зрительной клетке родопсин расположен а специализированных замкнутых мембранах, называемых дисками.

Основу фоторецепторной мембраны составляют фосфолипиды: фосфатидилхолии (40%), фосфатидилэтаноламин (38%) и фосфатидилсерин (13%). Очень низкое содержание холестерина и значительные количества (80% от общего содержания липидов) ненасыщенных жирных кислот делают фоторецепторную мембрану чрезвычайно жидкой, что имеет важное значение для функционирования родопсина.

Около 95% белкового состава фоторецепторных мембран приходится на долю родопсина. Содержание второго компонента — гликопротеииа с молекулярной массой около 250 ООО не превышает 2—3%. Функциональная роль этого белка в процессах фоторецепции пока остается неизвестной.

Полная аминокислотная последовательность родопсина была определена в 1982 г. в СССР Ю. А. Овчинниковым с сотр. и несколько позже подтверждена анализом соответствующего структурного гена родопсина Д. Хоггнесом и Дж. Натансом (США).

612

Биологические мембраны

Рис. 332. Топография родопсина в мембране.

Полипептидная цепь родопсина состоит из 348 аминокислотных остатков. Две олигосахаридные цепи присоединены к оствткам аспарагина в положении 2 и 15. Характерной особенностью аминокислотной последовательности родопсина, как и бактериородопсина, является наличие протяженных участков полипептидной цепи, состоящих из неполярных аминокислотных остатков, прерываемых сравнительно небольшими участками, содержащими полярные остатки. Аминокислотный остаток Lys-296, ответственный за связывание ретиналя, расположен ближе к С концу белка.

В настоящее время известны аминокислотные последовательности родопсинов из сетчатки глаза быка, человека, овцы. Эти белки содержат одинаковое число аминокислот, а их первичные структуры обладают аысокой степенью гомологии (около 90%).

С помощью анализа структурных генов Дж. Натансом о преде лены последовательности'трех белков из колбочек сетчаткн глаза человека, отвечающих за восприятие цвета. Это «красный», «голубой» и «зеленый» родопсины. «Красный» и «зеленый» родопсины обладают высокой степенью гомологии с белком из палочек, и лишь «голубой» родопсин значительно отличается по своей структуре от всех известных зрительных пигментов.

При установлении топографии родопсина в мембране использовались те же приемы, что и в случае бактериородопсина: ограничен-

ным протеолиз белка в составе на тинной мембраны, моноклональ-ные антитела, а также химическая модификация проникающими и непроникающими реагентами. Было показано, что мембранную часть молекулы родопсина составляют 7 сегментов полипептидной цепи, находящихся в а спиральной конформацни и пронизывающих толщу фоторецепторной мембраны (рис. 332). Наиболее значительными по величине участками, экспонированными в водную фазу, являются N-и С концевые области белка. Интересно, что специфическая укладка родопсина и бактериородопсина в мембране во многом аналогична, хотя белки практически не имеют структурной гомологии, а эволюционно их разделяет не один десяток миллионов лет.

Знание структуры родопсина открывает путь к пониманию того, каким образом функционирует этот важнейший белок. Молекула родопсина состоит из белковой части — олеина и хромофорной группы — 1 l-yuc-ретиналя, связанного с ним альдиминной связью. Ьелок обладает характерным спектром поглощения с максимумами при 280 и 500 нм. Поглощение при 500 нм обусловливается специфическим взаимодействием хромофора с белковым окружением.

Первым и важнейшим звеном в цепи событий, приводящих к зрительному возбуждению, является индуцированная светом изомеризация 11-уыс-ретиналя в полностью транс-форму. С момента поглощения кванта света молекула родопсина претерпевает ряд спектральных превращений

Родопсин (500 нм)

пс | hv Батородопсин (543 им) (прелюмиродопси и)

НС |

Люмиродопсин (497 нм) мке |

Метародопсии 1 (480 нм)

мс I Метародопсии И (380 нм)

с \ Метародопсии III 1

Опсин + полностью гранс-ретиналь (330 нм)

613

Характеристика отдельных биологических мембранных систем

Абдулаев Нажмутнн Гаджнмагомедо

внч (р. 1941), советский химик-биоорга-ник. Окончил Московский институт тонкой химической технологии им. M. В. Ломоносова (1967), работает в Институте биоорганической химии им М. М. Шемякина АН СССР. Основные работы посвящены выяснению структурных основ функционирования мембранных светочувствительных белков. Лауреат Государственной премии СССР (1986).

Таким образом, молекула родопсина проходит через ряд промежуточных стадий, превращаясь в молекулу олеина и свободный ретиналь. Весь процесс завершается в течение нескольких секунд.

Одно из важнейших событий, происходящих вслед за фотоизомеризацией ретиналя,— поляризация плазматической мембраны зрительной клетки. Эта мембрана в темноте проницаема для ионов натрия. Существующий в темноте градиент ионов натрия поддерживается Na' ,К * -зависимой АТФазой, расположенной в плазматической мембране внутреннего сегмента. Поглощение кванта света каким-то непонятным до сих пор механизмом блокирует поступление ионов натрия в клетку. Понижение скорости поступления ионов натрия внутрь клетки приводит к избыточному отрицательному заряду на внутренней стороне плазматической мембраны, т. е. гиперполяризации клетки. Именно этот сигнал.

614

Биологические мембраны

Скулачев Владимир Петрович (р. 1935), советский биохимик, член-корреспондент АН СССР (1974) Окончил Москов ский университет (1957), с 1973 г.— заведующий Межфакультетской проблемной лабораторией биоорганической химии и молекулярной биологии им. А. Н. Белозерского в МГУ. Основные работы — по изучению механизма превращения энергии в биологических мембранах. Лауреат Государственной премии СССР (1975).

возникший на плазматической мембране, и передается к синап и ческому окончанию зрительной клетки,

страница 80
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(28.04.2017)