Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

вции крупных пептидов — продуктов химического или ферментативного гидролиза белка. В то же время довольно часто они применяются и для первичного расщепления белков небольшой и средней молекулярной массы с целью получения «пе ре к ры веющихся фрагментов.

Для избирательного расщепления молекулы белка по остаткам лизина или аргинина в последние годы довольно широко используются новые ферменты. Среди них так называемая лизин-специфичная протеиназа, выделяемвя из грибов Armilaria mellea и кло-стрипаин из Clostridium histolyticum

I

--X — Lyi--- ¦

I

. —Arg— X--

Лизин-специфичная протеиназа в основном катализирует расщепление пептидных связей, образованных а-аминогруппой лизина, а клострипаин предпочтительно гидролизует связи, образованные карбоксильной группой остатков аргинина.

В распоряжении исследователей имеется также большой набор менее специфичных пратеолитических ферментов (пепсин, эластаза, субтилизин, папвин, проназа и др.). Эти ферменты используются в основном при дополнительной фрагментации пептидов. Их субстратная специфичность определяется природой аминокислотных оствтков не только образующих гидролизуемую связь, но и более удаленных по цепи.

Для исчерпывающего ферментативного гидролиза необходимо, чтобы белковая глобула находилась в денатурированном состоянии, т. е. все пептидные связи должны быть максимально доступными для атаки ферментом. В белке же, находящемся в нативной конформации, как правило, гидролизу подвергается только ограниченное число связей, расположенных на поверхности белковой молекулы, что приводит к образованию небольшого числа фрагментов. Этот процесс известен под названием ограниченного протеолиза. Реакции ограниченного протеолиза широко распространены в биологических системах, и с ними связано осуществление целого ряда физиологических процессов. В частности, к ним относятся процессы активации зимогенов протеиназ желудочно-кишечного тракта и сыворотки крови, процессинг многих гормонов и т. п.

Метод ограниченного протеолиза получил широкое распространение в структурно-функциональных исследованиях белков большой молекулярной массы. С помощью ограниченного протеолиза часто удается расщепить молекулу белка на небольшое число фрагментов и проводить дальнейшее исследование их строения, сводя таким образом одну сложную задачу к нескольким более простым.

Для реализации такого подхода необходимо выбрать протеолитиче кий фермент и подобрать условия, при которых полипептидная цепь исследуемого белка будет ги ролизоваться только по наиболее доступным пептидным связям. Важным условием ограниченного протеолиза является сохранение нативной конформацни белка. Поэтому при выделении белка следует избегать действия денатурирующих агентов. Во многих случаях удается расщепить молекулу белка на небольшое число фрагментов, если проводить гидролиз в условиях, которые снижают актив-

ность используемого пр теолитического фермента. Обычно такими условиями являются небольшое фермент-субстратное соотношение, пониженная температура, а также значение рН не соответствующее оптимуму действия фермента.

Так, при гидролизе основного белка миелина пепсином при рН 3.0, 37 С и фермент-субстратном соотношении 1:50 наблюдается образование 17 фрагментов; при рН 3.0, 24 С и фермент-субстратном соотношении 1 : 500 расщепление проходит главным образом по трем связям, а при рН 6 0 24 С и фермент-субстратном соотношении I : 500 расщепляется единственная связь Phe Рпе Молекулу мембранного белка можно расщепить на небольшое число фрагментов, если подвергать протеолизу нативную мембрану со встроенным в нее белком. При этом под действием фермента способны расщепляться только пептидные связи, находящиеся на поверхности мембраны (см. с. 608).

Химические методы расщепления. Среди химических методов фрагментации белков наиболее специфичным и чаще всего применяемым является расщепление бромцианом по остаткам метио-нина. Метод разработан в 1961 г. Э. Гроссом и Б. Виткопом и по избирательности действия не имеет себе равных.

Реакция с бромцианом проходит с образованием промежуточного циансульфониевого производного метионина, спонтанно превращающегося в кислых условиях в иминолактон гомосерина, который, в свою очередь, быстро гидролизуется с разрывом иминной связи. Получающийся на С-конце пептидов лвктои гомосерина далее чвстично гидролизуется до гомосерина (HSer), в результате чего каждый пептидный фрагмент, за исключением С концевого, существует в двух формах — гомосери новой и гомосеринлактоновой

Реакцию обычно проводят при комнатной температуре в течение 15—30 ч 49

в ильнокнслой среде (чаще всего в 70%-ной муравьиной кислоте) при ЮО-кратном _

избытке бромциана на каждый остаток метионина. В этих условиях связи, образо- Строение белков и пептилов

ванные остатками метионина, обычно расщепляются на 90—100 Исключение " составляют связи метионина с серином и треонином, расщепляющиеся ишь частично. В условиях обработки белка бромцианом может иметь место частичный гидролиз связи Asp—Pro. неустойчивой в кислой среде.

Г

сн,

-NH-CH-

Вг—С

о

II

С—NH-

R I

-СН-

СНз ¦ i

сн, о

I II

-NH-CH—C-

NH—СН—СО---

СН, о

I—NH—СН-С—NHj-CH—СО

Циа у ьфониееое производное

ХН,

\ i СН, О I

\ /

н—сн —с=о + I I

R i

-сн-

Иминолактои гомосерина

Гомосерин-лантон

Большое число методов предложено для расщепления белка по карбонильной группе остатка триптофана. Одним из используемых для этой цели реагентов является N бромсукцинимид

50 Под влиянием электрофнльного ai-снта карбонильная группа остатка трипто-

- фана способна вступать в ^-взаимодействие с двойной связью индольного кольца.

Белки и пептиды Г,РИ этом происходит окисление индола до гидроксииндолина, сопровождающееся

разрывом пептидной цепи. Реакция проводится при 2 3 кратном избытке реагента (рН 4,1): 20 °С; 2 ч). Расщепление триптофансодержащих пептидов N-бромсукци-нимндом происходит с выходом 50 — 90%, а белков — лишь 10 — 60",,. N-Бром-сукцннимид способен расщеплять также связи, образованные карбонильными группами остатков тирозина и гистидина, однако в более жестких условиях (увеличение избытка реагента, повышение температуры и понижение рН).

Более селективным реагентом является 2-(2-нитрофенилсуль-фенил)-З-метил-З-броминдол (BNPS-скатол), получаемый обработкой 2-(2-нитрофенил) сульфенилскатола N-бромсукцинимидом (А. Фонтана, 1972)

BN PS-скатол

При действии на белки BNPS-скатола происходит специфичное расщепление пептидной цепи только по остаткам триптофвна. Остатки метионина при этом окисляются до метионинсульфонв. Оптимальные условия проведения реакции 50°о ная уксусная кислота, 37 24 ч, 10-кратный избыток BNPS-скатола, выход составляет 30 — 70%. Реакция протекает по механизму, аналогичному механизму расщепления N-бромсукцииимидом.

В 1979 г. М. Хермодсон предложил новый метод расщепления пептидных связей, образованных остатками триптофане, с помощью о-иодозобензойной кислоты. Реагент селективно разрывает связи Trp — X, не модифицируя остатки тирозина и гистидина: метионин может окисляться до сульфоксида. Остатки цистеина и цистина необходимо предварительно защищать путем S-влки-

-NH-^CH—С—NH—СН2—С— _!----NH—сн

я! ^NH2 +н' Т

NHOH или ^OH PCHj—C—OH PCH2-C—NHOH

О о

а Аспартилгидроксама! g-Агпартилгидроисама!

лирования. Реакция проводится в 80%-ной уксусной кислоте в при- 51

сутствии 2-кратного избы кв о-иодозобензойной кислоты в течение ~

24 ч при 20 'С, выход достигает 70 — 100%. Строение белков и пептидов

В структурных исследованиях нашел применение метод расщепления полипептидной цепи гидроксиламином по связи аспараги-нил-глицил. Как показали исследования механизма реакции, с гидроксиламином взаимодействует циклический имид ангидрида аспар-тил-глицила, образующийся из аспарагинил-глицила. Этому превращению способствует предварительное выдерживание белка а кислой среде.

При реакции ангидровспартил-глицила с гидроксиламином в щелочной среде (рН 10,5) и при температуре 35—60 С происходит расщепление пептидной цепи с образованием смеси а- и р-аспартилгидроксаматов. У большинства изученных белков при действии гидроксила ми на в указанных условия^ проходило специфичное расщепление связей A.sn —Gly на 50 — 70°,,. Незначительный разрыв других пептидных свялей, например Аьп Leu, наблюдался редко.

В ряде случаев для расщепления белковых молекул используется метод частичного кислотного гидролиза. Наиболее чувствительными к действию кислот являются аспартильные пептидные саязи. Механизм реакции гидролиза, вероятно, включает в себя замещение карбоксильным анионом протонированного атома азота пептидной связи:

еО°" chN

сн сн

/ X и* / X

-NH С—NH---- -»- ---NH С—ЙН---

I п

Л

о о

II I

снГ \ сн, о

о I

СН / /И о

S —Г' + н,о / Ч У

—NH \. + H3N--- —-—»- —NH С

А I

Наименее устойчивы а кислых условиях связи Asp—Pro. Повышенная их лабильность обусловлена тем, что атом азота остатка пролина в пептидных саязях имеет наибольшую основность по сравнению с оствтквми других аминокислот и легче протонируется. Подобраны условия (10%-нвя уксуснвя кислота — пиридин, рН 2,5, 7 М гуанидин - HCI, 40 °С, 4 суток), при которых связи Asp—Pro расщепляются достаточно селективно и с большим выходом (до 90%).

52

Белки и пептиды

В 1974 г. А. Патчорник предложил метод расщепления пептидных связей, образованных остатком цистеина, с помощью 2-нитро-5-тиоцианатобензойной кислоты (НТЦБ):

NH—СН-I I

НТЦБ планирует остаток цистеина, превращая его в остаток fi тиоциапатоаланипа, который в мягких условиях (рН 8,0 — 9,0; 37 °С; 12— 16 ч) циклизуется в 2-иминотиазолидинкарбоновую кислоту с разрывом пептидной саязи. Расщепление полипептидной цепи по остаткам цистеина в указанных услоаиях специфично и обычно проходит с выходом 80 — 90%.

Существенным недостатком метода является то. что полученные при расщеплении фрагменты, за исключением N концевого, не содержат свободной а амин группы и поэтому не могут подвергаться деградации по методу Эдмана. С помощью восстановительного десульфировання на никелевом катализаторе удается превращать иминотиазолилинкарбонпную кислоту в аланин. Однако при этом наблюдается частичное расщепление некоторых пептидных связей.

Среди описанных методов химического расщепления наибольшее применение при исследовании первичной структуры белков находит деградация бромцианом по остаткам метионина. Относительно широко используется расщепление по остаткам триптофана и по связи Asn—Gly. Значительно реже применяют частичный кислотный гидролиз по саязи Asp—Pro и расщепление по остаткам цистеина и тирозина. При расщеплении белков по остаткам метионина, триптофана и цистеина обычно образуются крупные пептидные фрагменты, содержащие в среднем 40 — 80 аминокислотных остатков, что связано с низким содержанием этих аминокислот а белках. Более крупные пептиды могут быть получены при расщеплении связей Asn—Gly и Asp—Pro.

Выбор рациональной схемы разделения пептидов

53

Строение белков и пептидов

Разделение смеси пептидных фрагментов, образовавшихся при расщеплении полипептидной цепи белка ферментативными или химическими методами, является одним из наиболее сложных и ответственных этапоа в процессе определения первичной структуры. Успех иа этом зтапе во многом зависит от опыта, знаний, изобретательности исследователя и его искусства.

При выборе методов разделения пептидоа необходимо учитывать количества разделяемых веществ и их физико-химические свойства. Одним из основных параметров является длина полипептидной цепи. Методы разделения сравнительно коротких пептидов, содержащих до 15 — 20 аминокислотных остатков, хорошо разработаны.

Для первичного фракционирования смесей, содержащих несколько десятков пептидов, часто используют ионообменную хроматографию на катионитах типа дауэкс, представляющих собой сульфированный сополимер полистирола н дивинил-бензола (рис. °). Элюирование пептидов с колонки проводится с помощью специально подобранных градиента рН и концентрации летучего пиридин-ацетатного буфера. Детекция пептидного материала в к>ате осуществляется путем измерения оптического поглощения при 570 нм в пробе после реакции с нинтидрином. Иногда вместо нингндрина используется о-фталевый альдегид и какие-либо специфичные реакции (например, реакция Сакагучи, позволяющая обнаруживать аргннинсодержащие пептиды). Состав объединенных фракций после ионообменной хроматографии исследуется с помощью аналитической хроматографии в тонком слое целлюлозы и анализа концевых аминокислотных остатков. Результаты аналитических опытов служат основой для выбора последующей схемы деления и очистки пептидов. Для этой цели обычно применяются хроматография и электрофорез на бумаге или пластинках с тонким слоем целлюлозы или силикагеля.

При разделении менее сложных смесей (10 — 15 пептидоа) часто опускается стадия ионообменной хроматографии. Выбор схемы разделения проводится на основании анализа так нвзываемых «пептидных карт». Для получения пептидной карты (рис. 10) смесь пептидоа, образовавшаяся в результате ферментативного или химического гидролиза белка, наносится в аиде небольшой полоски на лист хроматографической бумаги или пластинки с тонким слоем целлюлозы и подвергается электрофорезу или хроматографии во взаимно перпендикулярных направлениях. После проявления пептидной карты специфичным реактивом иа бумаге или пластинке образуется характерный для данного белка набор пятен, их взаимное расположение позволяет оценить эффективность использованных методов разделения и выбрать оптимальный вариант.

С помощью метода пептидных карт можно проводить препаративное разделение смеси небольшого числа пептидов. Для этого при проявлении пептидной карты используются низкие концентрации соответствующих реактивов (нингндрина или

Отрицательно

заряженные

пептиды

Объем элюента

• Электрофорез в горизонтальном направлении ••им»* Хроматография в вертикальном направлении • '.V

Рис Ч. Разделение пептидов методом ионообменной хроматографии.

Рис. 10. Разделение пептидов методом пептидных карт.

54 флуорескамина) в результате чего значительная часть пептидов не реагирует с

реактивом и может быть элюирована с носителя для структурных исследований.

БеЛКи и пептиды Пептидные карты удобно применить также для выделения радиоактивно или

флуоресцентно меченных пептидов.

Значительно более трудную задачу представляет разделение смесей крупных пептидов, содержащих более 20 аминокислотных остатков. Основная сложность связана со свойством таких пептидоа «слипаться» в аодных растворах друг с другом и образовывать высокомолекулярные агрегаты. С целью предотвращения агрегации в буферные растворы добавляются детергенты (мочевина, гуанидин-гидрохлорид, додецилсульфат натрия).

• • • • • • •

Мелкие пептиды

Для разделения смеси крупных пептидов обычно применяется метод гель-фильтрации, позволяющим проводить фракционирование по молекулярной массе. В каче стве неподвижной фазы и с пользуются высоко гидрофильные декстраны с поперечными «сшивк

страница 8
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.10.2017)