Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

,2—1,5 л/моль липида. В отличие от Модельные мемораны

многослойных малые моноламеллярные липосомы не проявляют осмотической активности.

Размер липосом, получаемых обработкой ультразвуком, зависит от природы используемого липида. В случае кислых фосфолипидов (например, фосфатидилсерин, фосфатидилинозит и др.) образуются, как правило, липосомы меньшего размера (диаметр около 20 нм). Размер однослойных липосом также уменьшается по мере снижения длины жирно кислотных цепей фосфолипидных молекул. Напротив, включение холестерина в липосомы приводит к увеличению их диаметра до 35—40 нм.

Вследствие того что размеры малых липосом по порядку величины сравнимы Рис. 306. Элюирование малых монола-с толщиной образующего нх липидного бислоя, имеются значительные различия меллярных липосом на колонке с в расположении и характере упаковки липидных молекул на наружной и внутренней 2% ным гелем агарозы. сторонах мембраны. Прежде всего это проявляется в различном количестве молекул на обеих сторонах бислоя: в липосомах диаметром 20—25 нм наружный монослой содержит примерно вдвое больше липидных молекул, чем внутренний. Впервые такое различие удалось показать в 1°6ч г. В. Ф. Быстрову и Л. И. Барсукову с помощью предложенного ими метода ЯМР с использованием гидрофильных парамагнитных зондов, сдвигающих илн уширяющих сигналы от молекул на наружной стороне бислоя (рис. 307). Метод оказался также весьма полезным в установлении факта спонтанно возникающей асимметрии липидного бислоя в малых липосомах. В зависимости от размера полярных групп, их заряда, а также от длины и степени ненасыщенности углеводородных цепей наружный и внутренний монослои малых везикул могут значительно различаться по своему и пи д ному составу (рнс. 308). Как правило, нв наружной стороне бислоя находятся преимущественно те липиды, которые имеют более крупную полярную головку, некомпенсированный заряд, а также более длинные насыщенные углеводородные цепи. Липидные молекулы с более короткими илн ненасыщенными жирнокислотными остатками располагаются предпочтительно во внутренней половине бислоя.

Рис. 308. Асимметрия липидного бислоя на участках большой кривизны: S — площадь, приходящаяся на одну ли пидную молекулу на границе раздела мембрана — вода;

I — расстояние между полярными головками соседних липидных молекул: V — объем, занимаемый углеводородными цепями липидных молекул.

Липидные дисперсии, состоящие из малых моноламеллярных липосом, как правило, отличаются высокой устойчивостью к агрегации и не коагулируют в течение длительного времени. Поэтому эти дисперсии оказались весьма подходящими объектами для исследования различными спектральными методами. Недостатком малых липосом является небольшой внутренний объем, что ограничивает возможности их применения для моделирования транспортных функций мембранных систем.

Этого недостатка лишены большие моноламеллярные липосомы (рис. 309), которые в настоящее время широко используются для реконструкции различных систем мембранного транспорта. По своим свойствам они занимают промежуточное положение между малыми моноламеллярными липосомами и многослойными липосо-мами. Как и последние, большие моноламеллярные липосомы имеют значительный внутренний удельный водный объем (8—14 л/моль липида) и обладают осмотической активностью В то же время к ним применимы многие спектральные методы, что позволяет более полно охарактеризовать свойства образующего их липидного бислоя. Методы получения крупных моноламеллярных и малых липосом во многом сходны. Они аключают, например, удаление солюби-лизирующего детергента в условиях контролируемого диализа, а также инжекцию раствора липида в легколетучем растворителе (диэтилоаый эфир, нетролейный эфир, пента н) в подогретую до 60 °С водную фазу (метод обращение фазового упаривания). Крупные однослойные липосомы могут быть также получены из малых липосом путем их слияния под действием ионов Са2+ или в условиях термотропного фазового перехода.

В процессе приготовления липосом в их внутренний водный объем включаются те вещества, которые содержатся в исходном водном растворе. Обмен этими веществами между липосомами и окружающей средой связан с их прохождением через липидный бислой, являющийся диффузионным барьером, вследствие чего липосомы широко используются для выяснения барьерной функции липидов и для моделирования различных трвнепортных процессов.

Существующие методы изучения проницаемости липосом можно разделить на две группы: 1) методы, основанные на прямом измерении количества какого-либо вещества, вышедшего из липосом за определенный промежуток времени; 2) методы, основанные на осмотических свойстаах липосом. Наибольшее распространение получил метод прямого измерения концентрации диффундирующего вещества. Этот метод сравнительно прост в техническом отношении и особенно пригоден для веществ, имеющих низкую проницаемость, например для неорганических катионов и анионов, глюкозы, аминокислот ит. д. Обычно используются соединения, меченные радиоактивными изотопами: соли, содержащие "Na + , JКак модели, липосомы значительно ближе к биологическим мембранам, чем бислойные липидные пленки. Как и биологические мембраны, они представляют собой замкнутые системы, что делает их пригодными для изучения пассивного транспорта ионов и малых молекул через липидный бислой. В отличие от БЛМ, липосомы достаточно стабильны и не содержат органических растворителей. Состав липидов в липосомах можно произвольно варьировать и таким образом направленно изменять свойства мембраны. В настоящее время хорошо разработаны методы включения функционально-активных мембранных белков в липосомы. Такие искусственные бел ково-липидные структуры обычно называются протеолипо-сомами (рис. 310). Благодаря возможности реконструкции мембраны из ее основных компонентов удается моделировать ферментативные транспортные и реценторные функции клеточных мембран. В липосомы можно авести антигены, а также ковалентно присоединить антитела (рис. 311) и использовать их в иммунологических исследованиях. Они представляют собой удобную модель для изучения действия многих лекарственных веществ, витаминов, гормонов, антибиотиков ит.д. Как уже отмечалось, при образовании липосом водорастворимые вещества захватываются вместе с водой и попадают во внутреннее пространство липосом. Таким путем можно «начинять» липосомы различными веществами, включая

579

Модельные мембраны

Рис. 309. Микрофотографа я сколов крупных моноламелтярных липосом, полученных из азолектина удалени#м хола та натрия диализом. Оттеиенме Pi—С.

Рис. 310. Микрофотография сколов реконструированных протеолипосом. содержащих Na 1 ,К -АТФазу почек свиньи. Оттененне Pi—С.

580 лекарственные препараты, пептиды, белки и даже нуклеиноаые - кислоты и их фрагменты.

Биологические мембраны В настоящее время во многих лабораториях мира ведутся

интенсивные работы по выяснению возможностей медицинского применения липосом в качестве средства доставки различных лекарственных препаратов в определенные органы и ткани с целью воздействия на целый организм. По-видимому, наиболее интересные

Рн 311 Ковале ное присоединение ан перспективы практического применения липосом связаны с химио-тител к липосомам. терапией рака, лечением диабета, артритв и лейшманиоза, коррек-

цией ферментной недостаточности и исправлением дефектов клеточных мембран, модификацией иммунного ответа организма, а также с введением РНК и ДНК в клетки для решения проблем генной инженерии и биотехнологии.

Молекулярная организация

биологических мембран

В стремлении понять то, как устроены биологические мембраны, многие исследователи давно пытались свести все разнообразие различных мембранных систем к одной универсальной модели, которая объясняла бы имеющиеся экспериментальные факты. Однако возникновение ноаых методов открывало неизвестные ранее стороны в функционировании и структуре мембран и приводило к рождению новых идей и концепций.

Первые представления о структуре биологических мембран, по-видимому, следует связывать с предположением Э. Овертона о том, что мембрана должна иметь липидную природу (1899). В 1925 г. голландские исследователи Э. Гоотер и Ф. Грендель измерили площадь, занимаемую в монослое липидами, экстрагированными из мембраны эритроцитов, и пришли к выводу, что количества липидов, имеющихся в одной клетке, достаточно для образования по всей ее поверхности сплошного слоя толщиной в две молекулы. На основании этого они высказали гипотезу, что клеточная мембрана представляет собой двойной липидный слой, в котором гидрофильные группы липидных молекул локализованы на поверхности, а углеводородные цепи образуют гидрофобную внут реннюю область. Несмотря на то что в работе были допущены методические ошибки, представление о липидном бислое как о полупроницаемом барьере, окружающем клетку, захватило воображение биологов того времени и дало мощный толчок развитию дальнейших исследований.

Мысль о том, что с мембранами связаны белки, высказал впервые Дж. Даниелли в 1Q35 г. в связи с необходимостью объяснить явное расхождение между поверхностным натяжением на границе раздела масло — вода и мембрана — вода. Хотя в то время какая-либо информация о мембранных белках отсутствовала, Дж. Даниелли и X. Давсон в том же 1935 г. выдвинули гипотезу об общем принципе структурной организации клеточных мембран, в соответствии с которым мембрана представляется как трехслойная структура (рис. 312) —своеобразный сэндвич, где двойной слой ориентированных одинаковым образом липидных молекул заключен между двумя слоями глобулярного белка, формирующего границу мембраны с водой. Предполагалось, что в этой структуре связывание липидов с белками осуществляется за счет полярных взаимодействий. Поскольку толщина мембраны в то время не была известна, считалось, что пространство между двумя липидными монослоями может быть заполнено липоидным, жироподобным материалом.

581

Молекулярная организация биологических мембран

Гортер (Gorier | Эверт (1881 — 1954) голландский химик. Образование получил в Лейдене и Париже, с 1923 г.— профессор Лейденского университета. Основные работы посвящены коллоидной химии. Изучал мономолекулярные слои жирных кислот и белков, разработал методы анализа белков.

Липоид

Липид

Рис. 312. Модель Даниелли — Давсона

Белон

Впоследствии Дж. Даниелли в совместной работе с В. Стейном (1956) несколько усовершенствовал предложенную ранее модель, чтобы учесть возможность гидрофобных взаимодействий неполярных боковых цепей аминокислотных остатков с липидными молекулами, а также согласовать ее с уже известным в то время фактом облегченной диффузии через мембрану некоторых низкомолекулярных водорастворимых веществ. Было предположено, что белок на поверхности мембраны находится в развернутой коиформации, а его алифатические цепи частично проникают в липидный бислой (рис. 313). Нв отдельных участках мембраны белок полностью пронизывает липидный бислой формируя в нем поры, через которые могут транспортироваться различные водорастворимые вещества.

Пора

Белок

. 313. Модель Стейна — Даниелли.

9999999999

582

Биологические мембраны

Рис 314 Микрофотография мембраны эритроцита, полученная методом ультратонких срезов.

За период с 1936 по i960 г. с помощью методов дифракции рентгеновских лучей, поляризационной микроскопии, измерений электрических характеристик мембран, их проницаемости и поверхностной активности были получены многочисленные факты, свидетельствующие в пользу моделей Даниелли — Давсона. Но наиболее мощную поддержку эта модель получила на рубеже 1950—1960 гг. благодаря прогрессу, достигнутому в технике при-ютовления ультратонких срезов тканевых препаратов для электрон ной микроскопии. На полученных микрофотографиях различных мембран была отчетливо видна трехслойная структура толщиной 6—12,5 нм, состоящая из двух темных слоев электроне плотного материала по краям и светлого слоя в середине (рис. 315). Такая картина прекрасно соответствовала модели ли поп ротеи нового сэндвича, предложенной Дж. Даниелли и X. Давсоном.

Трехслойная структура наблюдалась на фиксированных срезах многих биологических мембран Основываясь на этом морфологи ческом сходстве, Дж. Д. Робертсон в 1959 г. предположил, что все клеточные мембраны — как плазматические, так и внутриклеточные — построены по единому принципу, и высказал концепцию унитарной (или единообразной) мембраны. В целом модель, предложенная Дж. Д. Робертсоном в 1960 г. (рис. 314), во многом сходна с классической моделью Дж. Даниелли: основу мембраны составляет липидный бислой, а ее нелипидные компоненты (прежде всего белок) в полностью развернутой конформации лежат на поверхности бислоя, связываясь с липидами электростатически и за счет гидрофобных взаимодействий. Однако в модели Робертсона нашла отражение еще одна важная структурная особенность мембраны — ее асимметрия.

iiliiiiii №

Лип ид

^VWWVWVV\ Белой Рнс. 315. Модечь Робертсона.

г\ _.Фосфагидил серии

J—-^-Холестерин

—Цереброзид

Сфингомиели+н

На структурную асимметрию биологических мембран указывали данные дифракции рентгеновских лучей, сиидететьс вовав и о неодинаковом характере распределения электронной плотности на противонежащих сторонах мембраны. В jtom отношении представляет интерес модель мембраны миелина, описанная Дж Б. Финеаном в 1957 |96о гг., в которой на основании данных рентгеновской дифракции подчеркнуты различия в распределении белка между двумя сторонами мембраны. Особенность модели Фннеана состоит еще и в том, что она представляет собой первую попытку описать структуру конкретной мембраны на основе рассмотрения реальной формы образующих ее липидных молекул.

Дальнейшее развитие техники электронной микроскопии, сопровождавшееся улучшением разрешения, и в частности применение нового метода, основанного на негативном контрастировании мембранных препаратов, позволило выявить морфологически более сложную картину структурной организации биологических мембран. Оказалось, что во многих случаях, и особенно на микрофотографиях внутриклеточных органелл, мембрана выглядит не как сплошная трехслойная линия, а как гранулярная структура, имеющая разрывы (или поры) и состоящая из отдельных глобулярных частиц.

Модель Шестранда

Модель Люси

Более того, попытки разобрать мембрану с помощью детергентов 583

привели к получению отдельных липопротеииовых фрагментов, из -

которых при удалении детергента удавалось вновь собрать мембра- Молекулярная организация

ноподобные структуры. Эти факты вызвали сомнения в правнль- биологических мембран

ности модели Робертсона и породили целый ряд новых моделей, в той или иной форме отражающих концепцию глобулярной организации биологических мембран.

Модель Бенсона Модель Грина— Пердью

Так, Ф. С. Шёстранд в 1963 г. предположил, что глобулярные частицы в мембране представляют собой липиды в форме мнцелл. Полярные головки липидных молекул находятся на поверхности мицечл покрытых слоем белка. В модели, предложенной Дж. А. Люси 1464) мнцелл ирная форма при

страница 76
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(21.08.2017)