Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

В результате состав ЛИПИДОВ на наружной Рис. 297. Асимметричное распредетение

стороне бислоя может быть иным, чем на внутренней. Это явление, и флил-флол липидных молекул вбислое. известное под названием «топологической асимметрии липидов», действительно имеет место в случае везикулярных липидных мембран. Факторы, влияющие на трансмембранное распределение липидных компонентов, весьма разнообразны, и изучение их в липидных бислоях способствует пониманию механизмов формирования топологически асимметричных биологических мембран.

- Модельные мембраны

Биологические мембраны

Бимолекулярные липидные мембраны (БЛМ), называемые также бислойными или «черными» липидными мембранами, представляют собой широко используемую экспериментальную модель, которая позволяет воспроизводить в искусственных условиях многие свойства и характеристики биологических мембран. Структурной

Раствор липида

4)

Падающий свет

Бимолекулярная (Черная) ипидная мембрана

Рис. 298. Процесс сформирования БЛМ.

Отраженный свет

а

• А

• L \ Отраженный

• л П * 4 свет

• \ * л» Падающий све

\ * :

V'/ « « «

Топстан пленка

Перегородка

г •

О

Диаметр до 2mi

Толщина

V

е ¦

43

Тонная пленка

Бимолекулярная мембрана

основой таких мембран является одиночный липидный бислой, 571

разделяющий две водные фазы и прикрепленный по периметру -

к инертной подложке из гидрофобного материала типа полиэтилена Модельные мембраны

или тефлона. Самопроизвольное образование мембраноподобной пленки на небольшом отверстии в перегородке, разделяющей два водных отсека, было впервые описано американским ученым П. Мюллером в 1962 г.

Предложенный П. Мюллером с сотрудниками способ формирования бислойных мембран технически прост. Квпельку раствора липида а органическом растворителе с помощью кисточки наносят под водой на отверстие диаметром 1—2 мм, сделанное в тонкой тефлоновой перегородке. Образующаяся при этом пленка сначала является довольно толстой и в отраженном свете имеет серый оттенок. Затем за счет действия сил поверхностного натяжения она в течение нескольких минут становится все тоньше и тоньше, приобретая вследствие интерференции саета яркую, постоянно меняющуюся радужную окраску. В этот момент пленка имеет толщину а пределах 100—600 нм. Наконец на пленке появляются сначала • отдельные черные пятна, а затем она вся становится «черной» (рис. 2(J8) Это происходит зв счет смыквния двух липидных моно слоев в один протяженный бислой, который вследствие своей мвлой толщины практически утрачивает отражательную способность по отношению к видимому свету. В процессе формирования бислоя ор-гвническин рвстворитель выдавливается к краям отверстия, где он образует визуально легко наблюдаемый толстый слой. Следует отметить, что образовавшаяся липидная пленкв не является идеально бимолекулярной. Она все еще содержит довольно значительное количество остаточного растворителя, который собнрвется в средней области бислоя в отдельные микролинзы (рис. 299).

Л \

Рис- 29°. Микролинзы растворителя в гидрофобной области БЛМ.

572 Можно, однако, приготовить так называемые «сухие» бислойные

мембраны, не содержащие органического растворителя, путем меха

Биологические мембраны нического приведения в соприкосновение двух моно молекулярных

слоев, образуемых липидом на границе раздела вода — воздух. Этот способ впервые был предложен японскими исследователями (М. Такаги и сотр., 1965) и впоследствии был усовершенствован М. Монталом (1972—1974). Важным преимуществом метода формирования БЛМ по М. Монталу является возможность получения асимметричных мембран из исходных монослоев разного л и пи дно го состава (рис. 300).

Для формирования бимолекулярных липидных мембран могут быть использованы в чистом виде или в смеси практически любые липиды. В первых работах мембраны приготовляли из плохо охв рактеризоввнных тканевых липидных экстрактов и затем получали их из индивидуальных липидов, как природных, так и синтетических. При формировании БЛМ по методу П. Мюллера применяется широкий набор различных растворителей, однако наилучшие результаты дает использование высших нормальных алканов, таких, как н-декан или н-тетрвдекаи.

Несмотря на кажущуюся простоту приготовления БЛМ, работа с ними требует от экспериментатора большого мастерствв, терпения и настойчивости. Существенной является проблема стабильности бислойных мембран, так как рано или поздно, а чаще всего в самый неподходящий момент любая мембрвнв лопается. Время жизни

Тефлоновая Отверстие Барьер перегородка У

I ^ I / Воздух

1 ~~~».~...п , .

I

Вода

I

Воздух

•од I мм*

4

Вода

Рис. 300. Схема формирования БЛМ из двух монослоев. Асимметричный липидный бислой

мембран обычно варьирует от нескольких минут до 1—3 ч. Нестабильность бислонных мембран вызывают разнообразные факторы, такие, как нвличие нежелательных примесей в образце, окисление липидов, загрязнение оборудования и посуды, неподходящий для формирования растворитель, колебания температуры, вибрация, резкие перепады концентрации и вязкости среды и т. д. Тем не менее образующийся липидный бислой обладает исключительно высокой механической прочностью и эластичностью. Бислойные мембраны выдерживают осторожное прикосновение стеклянной палочки, несколько прогибаясь при ее нажиме. Они легко деформируются под действием механического или осмотического давления, переходя при этом из плоской конфигурации в полусферу и обратно. Можно даже выдувать из бислоя так называемые сферические бислой, которые представляют собой пузырьки довольно большого размера с площадью поверхности до 50 мм (рис. 301). Более того, липидный бислой такого пузырька или плоской мембраны можно проткнуть волосом, тонкой проволочкой или кончиком стеклянного микроэлектрода и вынуть их обратно, не вызвав разрушения мембраны. Таким образом, липидный бислой обладает не только высокой прочностью, но и способностью к «самозалечиванию» его повреждений.

БЛМ отличаются также исключительно высокой устойчивостью к кратковременному действию сильного электрического поля. Электрический пробой мембраны происходит при потенциале около

Рис- 301. Образование сферической БЛМ.

4 • 10 В/см. По своим диэлектрическим свойствам липидный бислой не уступает лучшим из известных а настоящее время изоляторов, таким, как, например, твердый парафин, циркониеаый фарфор или поливинилхлорид. При этом, а отличие от пробоя в твердых телах, действие электрического поля на бислой является обратимым: после снятия поля мембрана полностью восстанавливает свои функции.

573

Модельные мембраны

574

Биологические мембраны

Какие характеристики липидного бислоя можно изучать, используя БЛМ как мембранную модель7 На рисунке 302 показана схема экспериментальной установки, обычно применяемой для проведения измерений на бислойных мембранах. Лучше всего эта модельная система подходит для измерения электрических характеристик липидного бислоя, таких, как электрическая емкость, проводимость, потенциал пробоя, мембранные потенциалы и др. Именно благодаря возможности проведения разнообразных электрических измерений БЛМ сыграли исключительно важную роль в изучении ионного транспорта через биологические мембраны. В таблице 25 сравниваются некоторые физические характеристики БЛМ и биологических мембран.

Рис. 302. Схема экспериментальной установки для изучения БЛМ. Светоприемнин

Высоноомиый измеритель 1 сопротивления 1"*^-0— -

Источнин напряжения

Источнин света

-»— Измерительная ячейна

Т-тефлоновая перегородив S-магнитная мешална

Таблица 25

Сравнение некоторых свойств искусственных бислойных н биологических мембран

Свойства Бислойные Биологические

мембраны мембраны

Толщина (нм) 4-9 4-13

Электрическое сопротивление (Ом - см1) 10*- 10' 10'-10"

Электрическая емкость (мкФ* см"а) 0.33 - 1 0,5 - 1,3

Потенциал пробоя (В/см) 10' - 10» 10' -10'

Поверхностное натяжение (мН-м ') 0.5-2 0,03 - 1

Проницаемость (мкм- с-1- 10 )

вода 31,7 0,37 - 400

мочевина 4,2 0,015 - 280

глицерин 4,6 0,003 - 27

эритрит 0,75 0,007 -5

Включение мембранных белков в бимолекулярные липидные мембраны открывает новые перспективы на пути дальнейшего сближения этой модельной системы с биологическими мембранами. В качестве примера успешной реконструкции функционально активных бислойных мембран можно привести слияние белок содержащих липосом с уже сформированными мембранами в условиях осмотического стресса или под действием ионов Са + и других агентов, облегчающих слияние мембран (рис. 303).

Таким образом, возможности практического использования бислойных мембран в различных исследованиях весьма широки и перспективы их применения непрерывно растут. Следует также указать на реальную возможность создания на основе бислойных мембран биосенсорных устройств. Можно ожидать, что созданные на этом принципе устройства будут обладать высокими технологическими параметрами, легкостью использования; портативностью, биосовместимостью и дешевизной.

Липосомы, Другой модельной системой, хорошо воспроизводящей многие свойства биологических мембран, являются липосомы. На возможность использования липосом а качестве моделей биологических мембран впервые обратил внимание А. Бэнгхем. В 1965 г. он показал, что фосфолипиды при набухании а аоде самопроизвольно образуют пузырькообразные частицы, которые состоят из множества замкнутых липидных бислоев, разделенных водными промежутками. Использование липосом в качестве модельных систем оказалось исключительно плодотворным и позволило выяснить целый ряд вопросов, касающихся молекулярной организации и функционирования биологических мембран.

В зависимости от размера частиц и числа образующих их липидных слоев липосомы подразделяются на три основных типа:

— многослойные (мультиламеллярные) липосомы, имеющие диаметр 5—10 мкм и насчитывающие до нескольких десятков, а то и сотен липидных бислоев;

— малые моноламеллярные липосомы, образованные одинарным липидным бислоем и имеющие диаметр в пределах 20—50 нм;

— крупные моноламеллярные липосомы, также образованные одиночным бислоем, с диаметром обычно от 50 до 200 нм, а иногда и более.

Многослойные липосомы (рис. 304), как правило, легко образуются при простом механическом встряхивании водной дисперсии набухшего липида. При этом получается гетерогенная взвесь липо-

575

Модельные мембраны

До СЛИЯНИЯ

После СЛИРНИЯ

I

•¦з

•*3

S3 •¦2

?

Липосома

Об а т слиянии у -я БЛМ

5 Й

Рис. 303. Образование бе к держащих БЛМ путем слияния липосом с плоским бислоем.

Рис. 304. Микрофотографии мн гост ньх липосом, образовавшихся из фосфатидилхолина:

а — негативное контрастирование моли б датом аммония; (б) — «замораживание — скалывание» (см. с. 583).

576

Биологические мембраны

Б»нгхем |Вапдпат| Алек Д. (р. 1921), английский биофизик. Окончил Лондонский университет (1944), с 1952 г.— ¦ Институте физиологии животных в Бабрахамв. Основные работы — по изучению физики и «имии клеточной поверхности, явлений адгезии и слияния клеток, свойств фосфолипидов и модельных мембран. Впервые предложил использовать липосомы в качестве моделей биологических мембран.

Рнс. 305. Микрофотография малых мо-ноламеллярных липосом, приготовленных из фосфатнднлхолнна обработкой ультразвуком (негативное контрастирование фосфовольфрамвтом калия).

сом с широким распределением частиц по размерам. Сравнительно гомогенную дисперсию липосом можно получать, пропуская их через фильтры с определенным размером пор. Способность фосфолипидов к диспергированию в водной среде с образованием липосом зависит от температуры фазового перехода липида. Так, липосомы легко получаются из ненасыщенных фосфолипидов, которые при обычных температурах находятся а жидкокристаллическом состоянии. В то же время фосфолипиды с насыщенными жирно кислотны ми остатками образуют липосомы только при температурах, превышающих температуру их фазового перехода. Существенную роль играет также природа полярной группы фосфолипида. Например, фосфатидилэтаноламин не дает замкнутых бислоев при диспергировании в солеаых растворах при нейтральных рН. Это объясняется слабой гидратацией полярных групп фосфатидилэта-ноламина вследствие образования солевой саязи между аминогруппами и фосфатными группами соседних молекул. Однако липосомы удается получить, если диспергирование фосфатидилэтаноламина проводить в растворах с низкой ионной силой и при аысоких значениях рН или диспергировать фосфатидилэтаноламин в смеси с фосфатидилхолином.

По данным ре итге неструктурно го анализа общая толщина липидного бислоя в многослойных липосомах из яичного фосфатидил-холина составляет 4 нм, а толщина его диглицеридной части раана 3 нм. Площадь, приходящаяся на одну молекулу фосфатидилхолина в липосомальном бислое, составляет около 0,72 нм2, что соответствует площади в фосфатидилхолиновом монослое, сжатом до давления 2,0—2,5-10 лц/см. Толщина водного промежутка между даумя соседними липидными бислоями составляет около 2—3 нм, но может возрастать до 20 нм и более в случае заряженных бислоев. Соответственно увеличивается и суммарный внутренний водный объем липосом. В среднем объем водной фазы многослойных липосом обычно составляет около 20—40% от их общего объема. В расчете на 1 моль липида (~~ 1000 г) многослойные липосомы могут включать от I до 4 л воды.

Большая часть внутренней воды многослойных липосом осмотически активна, благодаря чему они обладают свойствами идеального осмометра, меняя свой объем в ответ на изменение концентрации наружного раствора. В гипотонических растворах вода устремляется внутрь липосом и они быстро набухают. В гипертонических средах липосомы «сморщиваются за счет потери воды из межла меллярного пространства. Однако часть воды в липосомах остается осмотически неактивной. Например, у яичного фосфатидилхолина на 1 молекулу липида приходится около 25 молекул осмотически неактивной воды, что отвечает минимальной ширине межламелляр-ного пространства в 1,2—1,4 нм.

Мвлые моноламеллярные липосомы (рис. 305) могут быть получены при обработке многослойных липосом ультразвуком. Другие способы приготовления малых липосом аключают инжекцию (впрыскивание) спиртовых раствороа липидов а водную среду, экструзию (продавливание) водных липидных дисперсий под большим давлением в так называемом прессе Френча, а также удаление солюбилизирующего детергента диализом или гель-фнльтрвцией. Гомогенную фракцию малых липосом удается выделить при их гель-фильтрации на крупнопористых агарозных гелях (рис. 306) либо с помощью ультрацентрифугирования. По данным светорассеяния, аналитического ультрацентрифугирования и электронной микроскопии, средний диаметр моноламеллярных липосом, полученных из яичного фосфатидилхолина обработкой ультразвуком, составляет 25 нм, а их молекулярная масса равна 1,5-10*' — 2,1 -10\ Это соответствует 2—3 тыс. молекул фосфатидилхолина на одну липо-

сому. Диаметр внутренней водной полости малых липосом состав- 577 ляет 7—8 нм. Удельный водный объем малых липосом сравнительно

невелик и составляет всего 0

страница 75
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(26.06.2017)