|
|
Биоорганическая химиядролиз аминопептида-зами. Эти методы будут подробно рассмотрены в разделе, посвященном определению аминокислотной последовательности пептидов Среди химических методов определения С концевых амино кислотных остатков заслуживают внимания метод гидразинолиза, предложенный С. Акабори, и оксаэалоновый метод В. Матсуо. В первом из них при нагревании пептида или белка с безводным гидразином при 100 — 120 "С пептидные связи гидролиэуются с об Рис. 6. Разделение ДНС-производных аминокислот двумерной хроматографи ей на тонком слое силикагеля в различных системах растворителей. дне-он ль дне - он еив V N.. N, - Lys Val Mel Hli rnr Gly Phe Ale L«u N. - Lys Ser Pro Thr Gly A'9 0-Tyr Ser Pro N. - Lys Asp Glu Glu A»P разованием гидразидов аминокислот. С Концевая аминокислота остается в виде свободной аминокислоты и может быть выделена из реакционной смеси и идентифицирована. 39 Строение белков и пептидов R R2 R' о R3 -NH—СН—С—NH—СН—С—NH—СН—СГ----— NH2—С Н—С—NH—NH 2 + о о \>и о о + NH2—С Н—С—NH—NHj + NH2—С*Н—С^ Метод имеет ряд ограничений. При гидразинолизе разрушаются глутамин, аспарагин, цистеин и цистин аргинин теряет гуаниди-новую группировку с образованием орнитина. Гидраэиды серина, треонина и глицина лабильны и легко превращаются в свободные аминокислоты, что затрудняет интерпретацию результатов. 40 Белки и пептиды Оксазолоиовый метод, часто называемый методом трнтневой метки, основан на способности С концевого аминокислотного остатка под действием уксусного ангидрида подвергаться циклизации с образованием оксазолона. В щелочных условиях резко увеличивается подвижность атомов водорода в положении 4 оксазолонового кольца, и он может быть легко обменен на тритий. Образующиеся в результате последующего кислотного гидролиза трнтиированного пептида или белка продукты реакции содержат радиоактивно меченную С-концевую аминокислоту. Хромато-графнрование гидролизате и измерение радиоактивности позволяют идентифицировать С-конпевую аминокислоту пептида или белка. Аквборн [Akaborl| Сиро (р. 1900), японский химик-органик и биохимик, иностранный член АН СССР (1966). Окончил Тохоку университет в Сендае (1925), с 1938 г.— профессор Осакско-го университета. Основные труды посвящены выделению и анализу аминокислот, пептидов и белков. Предложил способ определения С-концевого аминокислотного остатка в белках или пептидах гидреэннолиэом. CHR2. МН 1 и I к, CHR N V f v -NH А О " - Lb ч CHR' . I I ----NH Н С»Ън сн>он R3 NH2 NHa нс* В некоторых с туча я к тритии включается в остатки аспарагиновой и глутаминовои кислот, расположенные в середине пептидной цепи. С-Концевые остатки н роли на в описанных условиях не образуют оксазолона, в в С концевые остатки треонина и серина обычно не удается ввести достаточного количества радиоактивной метки, что, вероятно, связано с деградацией последних в присутствии уксусного ангидрида. Чаще всего для определения С концевых аминокислотных остатков используют ферментативный гидролиз кврбоксипептидазами, позволяющий анализировать также и С-конценую вминокислотную последовательность. 41 Строение белкон и пептидов 41 Рис. 8. Жидкостной микроколоночный хроматограф ХЖ-1311 с флуоресцентным детектором (НТО АН СССР, г. Ленинград). Фрагментация полипептидной цепи Необходимый этвп в определении первичной структуры белка — расщепление белковой молекулы на пептидные фрагменты. Структурная химия белка располагает широким арсеналом химических и ферментативных методов фрагментации полипептидиой цепи. Выбор того или иного метода определяется конкретными физико-химическими свойствами изучаемого белка и общим стратегическим планом проведения исследования. Химические методы обладают высокой селективностью, однако процесс расщепления протекает, как правило, с выходом, не превышающим 50°0. Эти методы целесообразно использовать для получения крупных фрагментов, Возможности ферментативных методов гидролиза значительно шире, они дают как крупные, так и мелкие пептиды. Ферментативные методы гидролиза. Нанболее широко используемым ферментом при установлении первичной структуры белков является трипсин. Коммерческий бычий трипсин получают активацией его предшественника — трилсиногена, выделяемого из секрета поджелудочной железы. Трипсин относится к классу сери новых протеинвз и проявляет наибольшую активность в диапазоне рН 7,0—9,0. Фермент обладает уникальной субстратной специфич- иостью, катализируя гидролиз связей, образованных карбоксильными группами только основных аминокислот - лизина и аргинина. I . —Lys— X--¦ • I ---Arg— X--• • Гидролиз трипсином в оптимальных условиях происходит, как правило, с выходом, близким к 100%. Однако в ряде случаев на полноту и скорость протекания процесса оказывают влияние положение гидролизуемой связи в цепи и химическая природа боковых групп соседних аминокислотных остатков. Пептидные связи, рядом с которыми находятся свободные ct-амино- или а-карбоксильные группы, гидролизуются сравнительно медленно Так лизин, занимающий N к нцевое поло жение в рибонуклеазе и лизоциме, практически не отщепляется при гидролизе трипсином, а в В-цепн инсулина происходит только частичное расщепление связи лизина с С концевым ал а ни ном Как правило, соседство дикарбоиовых аминокислот (Asp и Glu) и особенно цистеиновой кислоты или карбокснметилцистеина затрудняет гидролиз пептидной связи трипсином. Однако практически во всех перечисленных случаях удается добиться достаточно полного гидролиза путем увезн-чения соотношения трипсин — субстрат или времени инкубации. Исключение составляют связи, образованные остатками лизина и аргинина с пролнном (Lys Pro и Arg Pro), абсолютно устойчивые к действию фермента. Трипсин обладает высокой избирательностью действия, и все же при достаточно большом времени инкубации и избытке фермента в ряде случаев наблюдается расщепление связей, включающих остатки ароматических аминокислот: тирозина, фенилаланина и триптофана. Коммерческие препараты трипсина могут содержать 0,05% примесей химотрипсина, поэтому во избежание аномальных разрывов пептидных связей применяют различные ингибиторы химотрипсина. Лучший из них — L (I тозиламид 2 феннлг-тил)хлорметилк тон (ТФХК) является аналогом ацилироваиного фенилаланина. Однако даже обработанный ТФХК трипсин иногда ги.чролизует типичные субстраты химотрипсина. По-видимому, проявление --Lys—Pro-- --Arg -Pro--• - О —с — с I V СН2—CI о н ТФХК в некоторых случаях химотрипсиноподобной активности объясняется структурной и функциональной особенностью самого трипсина. Не исключено, что другим фактором, вызывающим неспецифичность действия фермента, является повышенная чувствительность некоторых пептидных связей, определяемая пространственной структурой субстрата. Введение заместителей в боковые цепи лизина или аргинина препятствует гидролизу трипсином по остаткам модифицированных аминокислот и позволяет расщеплять белки избирательно только по остаткам аргинина или лизина соответственно. Особенно часто используется модификация оствтков лизина с последующим гидролизом белка по остаткам аргинина. В качестве модифицирующих агентов применяются ангидриды дикарбоновых кислот. В результате реакции ацилирования происходит замена положительного заряда остатка лизина на отрицательный заряд полуамида дикарбоио-вой кислоты: Малеиновыи ангидрид рН 3.5 В зависимости от природы используемого реагента модификация остатков лизина может быть как обратимой, так и необратимой. Обратимое блокирование t- -аминогрупп позволяет осуществлять последовательное расщепление белковой молекулы трипсином: вначале только по остаткам аргинина, а затем, после разделения образовавшихся пептидов и удаления защитных групп, и по остаткам лизина. Для обратимой модификации чаще всего используется реакция с малеи новым или цитраконовым ангидридами. Реакция ацилирования проводится при рН 8.5 — 4,0 и температуре 0--\-1 С в присутствии 20-кратного избытка реагента. Ма- леилькые производные лизина стабильны при нейтральных и щелочных значениях рН, а в кислой среде (рН 3,5; 40 С; 40 ч) гидролизуются, регенирируя свободную г-аминогруппу. В этих условиях может происходить частичное дезамидн рование белков, а также разрыв некоторых кислотолабильных связей, в частности между остатками аспарагиновой кислоты и пролина Ци ракони ьная группа удаляется в более мягких условиях (рН 3,5; 20 С; 4 ч), однако ее недостаток - пониженная устойчивость при щелочных значениях рН. Для необратимой модификации остатков лизина наилучшим агентом является янтарный ангидрид. 43 Строение белков и пептидов 2 - Мети л мел «и но вы й (циграконовый) ангидрид О Янтарный ангидрид Методы модификации остатков аргинииа в белках основаны на конденсации гуанидиновой группы с различными дикетонами и диальдегидами. Наибольшее применение среди них находит реакция с 1,2 цик огександионом предложенная в 1975 г. Л. Патти и Э. Смитом. Модификация протекает в мягких условиях (рН 8,0 — 9,0; 25 — 40 С) в натрий-6оратном буфере с образоввнием стабильного комплекса производного аргинина с боратом. Модифицирующая группировка удаляется путем обработки 0,5 М ги дро кс ила м и ном при рН 7,0. 37 "С, что дает возможность проводить последующее расщепление трипсином по освобождающимся остаткам аргинина. С помощью химической модификации можно также увеличивать число гидролизуемых трипсином связей. Для этой цели, в частности, используется аминоэтилирование остатков цистеина этиле-нимином (Л. Линдлей, 1956): I СН2 I сн Трипсин ^ Трипсин 5JC СИ, —СН, СН, 1 R XNH/ СН, I R ---NH—СН—СО—NH—СН—СО— - — ----NH—СН— СО— NH— СН—СО--- Пептидные связи, образованные карбоксильной группой S ф аминоэтил) цистеина, являющегося структурным аналогом лизина, способны расщепляться под действием трипсина, однако с меньшей скоростью, чем связи, образованные остатквми лизина и аргинина. Более полного расщепления можно достичь увеличением концентрации фермента и продолжительности гидролиза. Наряду с трипсином из поджелудочной железы выделяют другую сериновую протеиназу — химотрипсин. Используемый для структурных исследований а-химотрипсин А проявляет максимальную активность в диапазоне рН 7,8 — 9,0. Химотрипсин обладает гораздо более широкой специфичностью, чем трипсин. Фермент преимущественно катализирует гидролиз пептидных связей, образованных карбоксильными группами ароматических аминокислот — тирозина, феннлаланниа и триптофана. С меньшей скоростью гидролизуются пептидные связи лейцина, метионина, гистидина. Скорость расщепления отдельных связей в белках и пептидах зависит от характера соседних аминокислотных остатков. . Туг — X-- 45 Строение белков и пептидов ¦ ¦ ¦ —Leu—X— - 1 — Phe— X—. . . I . . —Met—X—¦ \ --Trp— X-- Смит |Smfth| Эмиль Л. (p. 1911), американский биохимик, иностранный член АН СССР (19В2). Окончил Колумбийский университет (1931), с 1963 г.— Профессор Калифорнийского университета в Лос-Анжелесе. Один из ведущих специалистов по химии и биохимии белков, в первую очередь ферментов. Установил первичную структуру ряда гистонов, глутаматдегидроге-назы и Др. белков. Автор (совместно с Р. Хиллом, И. Леманом и др.) широко известной книги «Основы биохимии». — His—х— Аналогично трипсину химотрипсин обычно медленно гндролизует связи, расположенные в непосредственной близости от свободных а-амино- и а карбоксильных групп. Наличие рядом с атакуемой химотрипсином связью отрицательного заряда (Glu, Asp, CMCys (карбокснметилцистеин) CysSO Н (цистеиновая кислота) существенно снижает скорость гидролиза, а присутствие основных аминокислот (Lys и Arg) увеличивает степень расщепления. Чрезвычайно затруднен гидролиз пептидных связей, образованных нминогруппой пролина. В последнее время при исследовании первичной структуры белков широкое применение находит протеиназв из Staphylococcus aureus, выделенная в 1972 г. Г. Р. Драпю, которая также относится к классу сериновых лротеинвз. Фермент имеет два максимума про-теолитической активности — при рН 4,0 и 7,8. Протеиназа из S. aureus с высоким выходом расщепляет пептидные связи, образованные карбоксильной группой глутаминовой кислоты. 1 —Glu— X— -I ¦---Азр— Leu--- - 46 Белкн и пептиды Гросс |Gro») Эрхард (1928—1981) американский химик-органик. Образование полуил в университетах АЛайнца и Франкфурта на Майне (Германия), с t973 г. руководил лабораторией молекулярных структур Национального института здоровья (США). Основные работы посвящены химии пептидов. Предложил метод расщепления пептидов с помощью бромциана (совместно с Б. Виткопом). В ряде случаев гидролизу подвергаются также связи, образованные остатком ас парат новой кислоты. Остатки гидрофобных аминокислот (особенно лейцин), следующие за остатками аспарагиновой кислоты, благоприятствуют такому гидролизу. Как и в случае трипсина и химотрипсина, связи, в образовании которых участвует нминогруппа пролина, не ра щепляют: я протеиназои из S. aureus Свободная карбоксильная группа С к нцевого аминокислотного остатка глутаминовои, аспарагиновой кислот и карбокснметилцистеина, а также свободная -амин групп значительно снижают скорость гидролиза, когда они располагаются рядом с атакуемой ферментом связью или даже отстоят от нее на один аминокислотный остаток. Термолизин, выделяемый из культуральной среды термофильной бактерии Bacillus thermoproteolyiicus, относится к классу нейтральных протеиназ, содержащих цинк в качестве кофактора. Термолизин необычайно термостабилен: в течение часа он полностью сохрвняет свою активность при 60 °С (рН 7.0) и теряет менее 50% активности при 80 С. Фермент устойчив в 8 М растворе мочевины, 20%-ном растворе этанола или метанола. Максимальную активность он проявляет в диапазоне рН 7,0 — 9,0. В отличие от большинства протеолитических ферментов, специфичность термолизина определяется природой остатка, которому принадлежит аминогруппа гидролизуемой связи. Термолизин преимущественно расщепляет пептидные связи, включающие аминокислотные остатки с гидрофобной боковой цепью (lie. Leu, Val, Phe, Туг, Trp). -Не — ._Х—Phe—. —X —Tyr- --X —Val— -X — Trp_. J _X— Ala--- . I —X —Met— С меньшей скоростью гидролиэуют я связи, в образовании которых участвуют остатки аланина и метиинина Присутствие свободных карбоксильных и а амин групп рядом с остатком гидрофобной аминокислоты несколько замедляет скорость гидролиза, а остаток пролина, следующий за остатком iидрофлбнои аминокислоты, препятствует гидролизу. Трипсин, протеиназа из S. aureus, химотрипсин и термолизин 47 являются ферментами, наиболее часто используемыми в настоящее--- время при установлении первичной структуры белков. Первые два Строение белков и пептидов из них, обладающие наиболее высокой специфичностью, применяются главным образом для первичного расщепления белковой молекулы. Термолизин и химотрипсин обычно служат инструментом для дополнительной фра меит |
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 |
Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb) |
[каталог] [статьи] [доска объявлений] [обратная связь] |