Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

дролиз аминопептида-зами. Эти методы будут подробно рассмотрены в разделе, посвященном определению аминокислотной последовательности пептидов

Среди химических методов определения С концевых амино кислотных остатков заслуживают внимания метод гидразинолиза, предложенный С. Акабори, и оксаэалоновый метод В. Матсуо. В первом из них при нагревании пептида или белка с безводным гидразином при 100 — 120 "С пептидные связи гидролиэуются с об

Рис. 6. Разделение ДНС-производных аминокислот двумерной хроматографи ей на тонком слое силикагеля в различных системах растворителей.

дне-он

ль дне - он еив

V N.. N, - Lys Val Mel Hli rnr Gly

Phe Ale L«u N. - Lys Ser Pro

Thr Gly A'9 0-Tyr

Ser Pro N. - Lys

Asp Glu Glu A»P

разованием гидразидов аминокислот. С Концевая аминокислота остается в виде свободной аминокислоты и может быть выделена из реакционной смеси и идентифицирована.

39

Строение белков и пептидов

R R2 R' о R3 -NH—СН—С—NH—СН—С—NH—СН—СГ----— NH2—С Н—С—NH—NH 2 +

о о \>и о

о

+ NH2—С Н—С—NH—NHj + NH2—С*Н—С^

Метод имеет ряд ограничений. При гидразинолизе разрушаются глутамин, аспарагин, цистеин и цистин аргинин теряет гуаниди-новую группировку с образованием орнитина. Гидраэиды серина, треонина и глицина лабильны и легко превращаются в свободные аминокислоты, что затрудняет интерпретацию результатов.

40

Белки и пептиды

Оксазолоиовый метод, часто называемый методом трнтневой метки, основан на способности С концевого аминокислотного остатка под действием уксусного ангидрида подвергаться циклизации с образованием оксазолона. В щелочных условиях резко увеличивается подвижность атомов водорода в положении 4 оксазолонового кольца, и он может быть легко обменен на тритий. Образующиеся в результате последующего кислотного гидролиза трнтиированного пептида или белка продукты реакции содержат радиоактивно меченную С-концевую аминокислоту. Хромато-графнрование гидролизате и измерение радиоактивности позволяют идентифицировать С-конпевую аминокислоту пептида или белка.

Аквборн [Akaborl| Сиро (р. 1900), японский химик-органик и биохимик, иностранный член АН СССР (1966). Окончил Тохоку университет в Сендае (1925), с 1938 г.— профессор Осакско-го университета. Основные труды посвящены выделению и анализу аминокислот, пептидов и белков. Предложил способ определения С-концевого аминокислотного остатка в белках или пептидах гидреэннолиэом.

CHR2. МН

1 и I

к,

CHR N V f v

-NH А

О

" - Lb ч

CHR' . I I ----NH Н

С»Ън сн>он R3

NH2 NHa нс*

В некоторых с туча я к тритии включается в остатки аспарагиновой и глутаминовои кислот, расположенные в середине пептидной цепи. С-Концевые остатки н роли на в описанных условиях не образуют оксазолона, в в С концевые остатки треонина и серина обычно не удается ввести достаточного количества радиоактивной метки, что, вероятно, связано с деградацией последних в присутствии уксусного ангидрида.

Чаще всего для определения С концевых аминокислотных остатков используют ферментативный гидролиз кврбоксипептидазами, позволяющий анализировать также и С-конценую вминокислотную последовательность.

41

Строение белкон и пептидов

41

Рис. 8. Жидкостной микроколоночный хроматограф ХЖ-1311 с флуоресцентным детектором (НТО АН СССР, г. Ленинград).

Фрагментация полипептидной цепи

Необходимый этвп в определении первичной структуры белка — расщепление белковой молекулы на пептидные фрагменты. Структурная химия белка располагает широким арсеналом химических и ферментативных методов фрагментации полипептидиой цепи. Выбор того или иного метода определяется конкретными физико-химическими свойствами изучаемого белка и общим стратегическим планом проведения исследования. Химические методы обладают высокой селективностью, однако процесс расщепления протекает, как правило, с выходом, не превышающим 50°0. Эти методы целесообразно использовать для получения крупных фрагментов, Возможности ферментативных методов гидролиза значительно шире, они дают как крупные, так и мелкие пептиды.

Ферментативные методы гидролиза. Нанболее широко используемым ферментом при установлении первичной структуры белков является трипсин. Коммерческий бычий трипсин получают активацией его предшественника — трилсиногена, выделяемого из секрета поджелудочной железы. Трипсин относится к классу сери новых протеинвз и проявляет наибольшую активность в диапазоне рН 7,0—9,0. Фермент обладает уникальной субстратной специфич-

иостью, катализируя гидролиз связей, образованных карбоксильными группами только основных аминокислот - лизина и аргинина.

I

. —Lys— X--¦ •

I

---Arg— X--• •

Гидролиз трипсином в оптимальных условиях происходит, как правило, с выходом, близким к 100%. Однако в ряде случаев на полноту и скорость протекания процесса оказывают влияние положение гидролизуемой связи в цепи и химическая природа боковых групп соседних аминокислотных остатков. Пептидные связи, рядом с которыми находятся свободные ct-амино- или а-карбоксильные группы, гидролизуются сравнительно медленно Так лизин, занимающий N к нцевое поло жение в рибонуклеазе и лизоциме, практически не отщепляется при гидролизе трипсином, а в В-цепн инсулина происходит только частичное расщепление связи лизина с С концевым ал а ни ном Как правило, соседство дикарбоиовых аминокислот (Asp и Glu) и особенно цистеиновой кислоты или карбокснметилцистеина затрудняет гидролиз пептидной связи трипсином. Однако практически во всех перечисленных случаях удается добиться достаточно полного гидролиза путем увезн-чения соотношения трипсин — субстрат или времени инкубации. Исключение составляют связи, образованные остатками лизина и аргинина с пролнном (Lys Pro и Arg Pro), абсолютно устойчивые к действию фермента.

Трипсин обладает высокой избирательностью действия, и все же при достаточно большом времени инкубации и избытке фермента в ряде случаев наблюдается расщепление связей, включающих остатки ароматических аминокислот: тирозина, фенилаланина и триптофана. Коммерческие препараты трипсина могут содержать 0,05% примесей химотрипсина, поэтому во избежание аномальных разрывов пептидных связей применяют различные ингибиторы химотрипсина. Лучший из них — L (I тозиламид 2 феннлг-тил)хлорметилк тон (ТФХК) является аналогом ацилироваиного фенилаланина. Однако даже обработанный ТФХК трипсин иногда ги.чролизует типичные субстраты химотрипсина. По-видимому, проявление

--Lys—Pro--

--Arg -Pro--• -

О

—с — с

I V

СН2—CI

о

н

ТФХК

в некоторых случаях химотрипсиноподобной активности объясняется структурной и функциональной особенностью самого трипсина. Не исключено, что другим фактором, вызывающим неспецифичность действия фермента, является повышенная чувствительность некоторых пептидных связей, определяемая пространственной структурой субстрата.

Введение заместителей в боковые цепи лизина или аргинина препятствует гидролизу трипсином по остаткам модифицированных аминокислот и позволяет расщеплять белки избирательно только по остаткам аргинина или лизина соответственно. Особенно часто используется модификация оствтков лизина с последующим гидролизом белка по остаткам аргинина. В качестве модифицирующих агентов применяются ангидриды дикарбоновых кислот. В результате реакции ацилирования происходит замена положительного заряда остатка лизина на отрицательный заряд полуамида дикарбоио-вой кислоты:

Малеиновыи ангидрид

рН 3.5

В зависимости от природы используемого реагента модификация остатков лизина может быть как обратимой, так и необратимой. Обратимое блокирование t- -аминогрупп позволяет осуществлять последовательное расщепление белковой молекулы трипсином: вначале только по остаткам аргинина, а затем, после разделения образовавшихся пептидов и удаления защитных групп, и по остаткам лизина.

Для обратимой модификации чаще всего используется реакция с малеи новым или цитраконовым ангидридами. Реакция ацилирования проводится при рН 8.5 —

4,0 и температуре 0--\-1 С в присутствии 20-кратного избытка реагента. Ма-

леилькые производные лизина стабильны при нейтральных и щелочных значениях рН, а в кислой среде (рН 3,5; 40 С; 40 ч) гидролизуются, регенирируя свободную г-аминогруппу. В этих условиях может происходить частичное дезамидн рование белков, а также разрыв некоторых кислотолабильных связей, в частности между остатками аспарагиновой кислоты и пролина Ци ракони ьная группа удаляется в более мягких условиях (рН 3,5; 20 С; 4 ч), однако ее недостаток - пониженная устойчивость при щелочных значениях рН. Для необратимой модификации остатков лизина наилучшим агентом является янтарный ангидрид.

43

Строение белков и пептидов

2 - Мети л мел «и но вы й (циграконовый) ангидрид

О

Янтарный ангидрид

Методы модификации остатков аргинииа в белках основаны на конденсации гуанидиновой группы с различными дикетонами и диальдегидами. Наибольшее применение среди них находит реакция с 1,2 цик огександионом предложенная в 1975 г. Л. Патти и Э. Смитом. Модификация протекает в мягких условиях (рН 8,0 — 9,0; 25 — 40 С) в натрий-6оратном буфере с образоввнием стабильного комплекса производного аргинина с боратом.

Модифицирующая группировка удаляется путем обработки 0,5 М ги дро кс ила м и ном при рН 7,0. 37 "С, что дает возможность проводить последующее расщепление трипсином по освобождающимся остаткам аргинина.

С помощью химической модификации можно также увеличивать число гидролизуемых трипсином связей. Для этой цели, в частности, используется аминоэтилирование остатков цистеина этиле-нимином (Л. Линдлей, 1956):

I

СН2 I

сн

Трипсин ^ Трипсин

5JC СИ, —СН,

СН, 1 R XNH/ СН, I R

---NH—СН—СО—NH—СН—СО— - — ----NH—СН— СО— NH— СН—СО---

Пептидные связи, образованные карбоксильной группой S ф аминоэтил) цистеина, являющегося структурным аналогом лизина, способны расщепляться под действием трипсина, однако

с меньшей скоростью, чем связи, образованные остатквми лизина и аргинина. Более полного расщепления можно достичь увеличением концентрации фермента и продолжительности гидролиза.

Наряду с трипсином из поджелудочной железы выделяют другую сериновую протеиназу — химотрипсин. Используемый для структурных исследований а-химотрипсин А проявляет максимальную активность в диапазоне рН 7,8 — 9,0. Химотрипсин обладает гораздо более широкой специфичностью, чем трипсин. Фермент преимущественно катализирует гидролиз пептидных связей, образованных карбоксильными группами ароматических аминокислот — тирозина, феннлаланниа и триптофана. С меньшей скоростью гидролизуются пептидные связи лейцина, метионина, гистидина. Скорость расщепления отдельных связей в белках и пептидах зависит от характера соседних аминокислотных остатков.

. Туг — X--

45

Строение белков и пептидов

¦ ¦ ¦ —Leu—X— -

1

— Phe— X—. . .

I

. . —Met—X—¦ \

--Trp— X--

Смит |Smfth| Эмиль Л. (p. 1911), американский биохимик, иностранный член АН СССР (19В2). Окончил Колумбийский университет (1931), с 1963 г.— Профессор Калифорнийского университета в Лос-Анжелесе. Один из ведущих специалистов по химии и биохимии белков, в первую очередь ферментов. Установил первичную структуру ряда гистонов, глутаматдегидроге-назы и Др. белков. Автор (совместно с Р. Хиллом, И. Леманом и др.) широко известной книги «Основы биохимии».

— His—х—

Аналогично трипсину химотрипсин обычно медленно гндролизует связи, расположенные в непосредственной близости от свободных а-амино- и а карбоксильных групп. Наличие рядом с атакуемой химотрипсином связью отрицательного заряда (Glu, Asp, CMCys (карбокснметилцистеин) CysSO Н (цистеиновая кислота) существенно снижает скорость гидролиза, а присутствие основных аминокислот (Lys и Arg) увеличивает степень расщепления. Чрезвычайно затруднен гидролиз пептидных связей, образованных нминогруппой пролина.

В последнее время при исследовании первичной структуры белков широкое применение находит протеиназв из Staphylococcus aureus, выделенная в 1972 г. Г. Р. Драпю, которая также относится к классу сериновых лротеинвз. Фермент имеет два максимума про-теолитической активности — при рН 4,0 и 7,8. Протеиназа из S. aureus с высоким выходом расщепляет пептидные связи, образованные карбоксильной группой глутаминовой кислоты.

1

—Glu— X— -I

¦---Азр— Leu--- -

46

Белкн и пептиды

Гросс |Gro») Эрхард (1928—1981) американский химик-органик. Образование полуил в университетах АЛайнца и Франкфурта на Майне (Германия), с t973 г. руководил лабораторией молекулярных структур Национального института здоровья (США). Основные работы посвящены химии пептидов. Предложил метод расщепления пептидов с помощью бромциана (совместно с Б. Виткопом).

В ряде случаев гидролизу подвергаются также связи, образованные остатком ас парат новой кислоты. Остатки гидрофобных аминокислот (особенно лейцин), следующие за остатками аспарагиновой кислоты, благоприятствуют такому гидролизу. Как и в случае трипсина и химотрипсина, связи, в образовании которых участвует нминогруппа пролина, не ра щепляют: я протеиназои из S. aureus Свободная карбоксильная группа С к нцевого аминокислотного остатка глутаминовои, аспарагиновой кислот и карбокснметилцистеина, а также свободная -амин групп значительно снижают скорость гидролиза, когда они располагаются рядом с атакуемой ферментом связью или даже отстоят от нее на один аминокислотный остаток.

Термолизин, выделяемый из культуральной среды термофильной бактерии Bacillus thermoproteolyiicus, относится к классу нейтральных протеиназ, содержащих цинк в качестве кофактора. Термолизин необычайно термостабилен: в течение часа он полностью сохрвняет свою активность при 60 °С (рН 7.0) и теряет менее 50% активности при 80 С. Фермент устойчив в 8 М растворе мочевины, 20%-ном растворе этанола или метанола. Максимальную активность он проявляет в диапазоне рН 7,0 — 9,0. В отличие от большинства протеолитических ферментов, специфичность термолизина определяется природой остатка, которому принадлежит аминогруппа гидролизуемой связи. Термолизин преимущественно расщепляет пептидные связи, включающие аминокислотные остатки с гидрофобной боковой цепью (lie. Leu, Val, Phe, Туг, Trp).

-Не —

._Х—Phe—.

—X —Tyr-

--X —Val—

-X — Trp_.

J

_X— Ala--- .

I

—X —Met—

С меньшей скоростью гидролиэуют я связи, в образовании которых участвуют остатки аланина и метиинина Присутствие свободных карбоксильных и а амин групп рядом с остатком гидрофобной аминокислоты несколько замедляет скорость гидролиза, а остаток пролина, следующий за остатком iидрофлбнои аминокислоты, препятствует гидролизу.

Трипсин, протеиназа из S. aureus, химотрипсин и термолизин 47

являются ферментами, наиболее часто используемыми в настоящее---

время при установлении первичной структуры белков. Первые два Строение белков и пептидов из них, обладающие наиболее высокой специфичностью, применяются главным образом для первичного расщепления белковой молекулы. Термолизин и химотрипсин обычно служат инструментом для дополнительной фра меит

страница 7
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.08.2017)