ием (100 С, 5 ч) глико-протеина с безводным гидразином.

В последние годы широкое применение нашли эндогликози-дазы, прежде всего эндо-р-М-ацетилглюкозаминидазы, гидроли-зующие гликозидную связь в хитобиозильном остатке, соединенном с аспарагином полипептидиой цепи- Обнаружена и эндо-р1 N-ацетил глюкозами ни даза, гидролизу ющая связь между терминальным N-ацетилглюкозамииом и аспарагином- Названные срерменты способны расщеплять гликозидные связи как в гликопептидах так и в интактных гликопротеинах, что открывает возможность изучения биологической роли углеводных детерминант. Ферменты из разных источников отличаются по специфичности: возможность гидролиза определяется строением значительной части олигосахарида, а не только структурой моносахаридного звена, гликозидная связь при котором расщепляется.

В большинстве случаев N гликозидные цепн по туча ют не в виде олигосахаридов, а в виде гликопептидов. С этой целью проводится исчерпывающий протеолиз с использованием проназы. Двух-, трехкратная обработка гликопротеина проиазой позволяет получать гликопептиды, содержащие минимальное число аминокислотных остатков, в предельном случае лишь один аспарагин, который может быть отщеплен от олигосахарида с помощью другого фермента — гликозиласпарагиназы.

Определение структуры олигосахаридных цепей проводится стандартными методами, описанными ранее При исследовании гликопротеинов животного происхождения задача облегчается тем, что в их составе встречаются лишь семь моносахаридов: N ацетил глюкозамин, N-ацетилгалактозамин, ней рами нова я кислота, манно-за, галактоза, фукоза и глюкоза. Более того, в большинстве случаев структуры углеводных цепей определенного типа, выделенных из разных гликопротеинов, оказываются построенными из одинаковых блоков.

Общие черты обнаруживаются и в структуре О-гликозидных цепей. Как правило, базовую часть их составляет дисахарид P-D-Gal-(l-^3)-D-GalNAc, присоединенный а-связью к серину или треонину полипептида. К базовому олигосахариду могут быть присоединены остатки терминальных Сахаров — нейраминовой кислоты и фукозы.

475

Строение углеводов и углеводсодержащих биополимеров

Ch ОН

P-GlcNAc-(t -4)-GlcNAc

Хитобиозв

476 Ниже приведены структуры О гликозид вяза ных олигосаха-- ридов из муцинов подчелюстных желез.

Углеводы Базовый фрагмент может быть также представлен диса хари дом

P-D-GalNAc-(l-^3)-GalNAc, в котором остаток N-ацетилглюкоза-мина служит отправной точкой для образования сложных цепей с терминальными последовательностями, характерными для групповых веществ крови.

a-NeuNAc-(2 -6)-a-GalNAc-I-*R p-Gel-(l —i)-a-GalNAc-]

I; • t; [

6

, 2

ct-Fuc a-NeuNAc

a-GalNAc-(l~3)-fl-Gal-(l— .))-tz-GalNAc-l—R

t. IS

a-Fuc a-NeuNAc R=Ser/Thr

Определение мест привязки олигосахаридных цепей в белках проводится путем подбора таких условий расщепления полипептидной цепи, которые позволили бы получить фрагменты, несущие лишь по одной углеводной цепочке. После определения последовательности аминокислот и положения углеводной цепи в глико пептиде локализуют его положение в исходной молекуле.

Анализ первичной структуры углеводных биополимеров — гораздо более сложная задача, чем структурный анализ белков и нуклеиновых кислот. Несмотря на значительные успехи, достигнутые в последние годы, универсальная схема исследования структуры олиго и полисахаридов отсутствует. Как следствие, автоматизация определения первичной структуры таких биополимеров на сегодня невозможна.

Пространственное строение углеводов

Конформацни моносахаридов и их производных. Циклические формулы Хеуорса не вполне точно отражают действительную структуру молекул моносахаридов. Благодаря свободному вращению групп вокруг ординарных связей они могут принимать различные конформацни.

Конформацни ациклических и циклических форм моносахаридов наглядно изображаются перспективными, или проекционными, формулами (формулами Ньюмена). Ниже представлены наиболее стабильные конформацни D эритрозы и D треозы

Стабильность этих конформации, называемых трансоидными 477

осусловлена наибольшей удаленностью друг от друга объемистых »-

заместителей (СН\ОН и СНО). В соединениях с длинной цепью Строение углеводов

углеродных атомов наиболее выгодной оказывается конформация, и углеводсодержащии

при которой цепь имеет зигзагообразный характер- биополимеров

То

Конформации пираноз и их производных сходны с конформа-циями циклогек ана, однако наличие кислородного атома в цикле увеличивает их возможное число. В подавляющем большинстве случаев реализуется одна из изображенных ниже конформации типа «кресло» (4С, или 'С«), конформации типа «ванна» практически не встречаются.

Какая из них окажется более выгодной — зависит от размера и расположения соответствующих группировок в конкретном моносахариде. Заместители со связями, параллельными оси X — X, называют аксиальными (а). Если же связь заместителя с кольцом образует с осью X — X тетраэдрический угол, такой заместитель называют экваториальным (е).

Конформация с наименьшим числом объемистых аксиальных группировок (в частности, СН.ОН-. NHAc-, ОН-групп) наиболее стабильна, поэтому из двух конформации, приведенных для ме-тил р* D глюкопиранозида безусловно, предпочтительной окажется конформация 4С1щ в которой все гидроксильные, а также объемистая метилольная группировки расположены экваториально.

СНоОН

ОМе

СН;ОН

Кресло (*С>

4v. vl

Ванна ( *В)

Конформация 4С является предпочтительной для большинства альдогексоз D-ряда. хотя, например, в случае D-идозы преимущественной оказывается конформация типа С

Существенный вклад в стабильность конформации пираноз вносит так называемый н мерный эффект — диполь-дипольное взаимодействие электроотрицательного заместителя при С-1 с неподеленной парой электронов атома кислорода цикла, в результате которого заместите 1ь при С-1 стремится принять аксиальное положение. Для галпенпрои шодных этот эффект настолько значителен, что, например. 2,3,4-три-0-ацетил-р-0-ксилопнранознлфторид в растворе имеет конформацию 1С* с тремя аксиальными ацетильными группами.

478

Углеводы

АсО

Другим следствием эффекта является то, чтя незамещенные альдозы D-ряда в водном растворе имеют преимущественно а конфигурацию гидроксильной группы при С-1.

Лемье |Lcmleux| Раймонд Ургель

(р. 1920), канадский химик-органик. Окончил университет Альберта в Эдмонтоне (1943), с 1961 г.— профессор этого университета Основные работы— в области химии углеводов. Осуществил химический синтез многих сложных сахаридов. Внес значительный вклад в конформационный анализ углеводов с помощью метода ЯМР.

Еще пдин фактор заметно влияющий на стабильность конформацни, так называемый \ эффект при аксиальном расположении гидроксильной группы при С 2 и экваториальном расположении заместителя при С-1 кислородные атомы двух таких группировок, а также кислорода цикла оказываются сближенными, что приводит к их сильному отталкиванию.

С. Энджиэлом и Р. Лемье был определен вклад рассмотренных «факторов неустойчивости», а также взаимодействий других атомов пираноз в конформационную стабильность моносахаридов и на этой основе разработана система оценки выгодности той или иной коиформации, позволяющая предсказывать предпочтительную конформацию моносахарида. Рассчитанные конформацни в большинстве случаев хорошо согласуются с экспериментальными данными, однако встречаются и исключения. В частности, аксиальное расположение объемистого заместителя может оказаться более выгодным за счет образования водородной или ионной связи, диполь-диполь-ного взаимодействия и т. д.

Основным физико химическим методом изучения конформацни Сахаров в растворе служит протонный магнитный резонанс. По величине химического сдвига протонов и константам их спии-спино-вого взаимодействия можно судить о том, занимают ли они аксиальное или экваториальное положение. Для оценки конформацни Сахаров в кристаллах применяется рентгеноструктурный анализ.

Пространственная структура олиго- и полисахаридов. Пространственное строение полисахаридов определяется прежде всего первичной структурой макромолекулы. Неразветвленные полисахариды с р1 (I "4) гликозилными связями, такие как целлюлоза и хитин, образуют фибриллярные структуры, для которых характерна линейная конформация молекул, закрепленная водородными вязями. Подобные макромолекулы, располагаясь приблизительно парал-

лельными пучками, образуют структуры, регулярные в трех измерениях, что характерно для кристаллов. Наиболее мощным инструментом изучения пространственного строения подобных полисахаридов оказался рентгеноструктурный анализ. Изучение рентгенограмм позволило определить тип и рассчитать параметры элементарной кристаллической ячейки целлюлозы (а также хитина и ряда других линейных полисахаридов), определить конформацию моносахаридных остатков. Так, для целлюлозы и хитина было показано, что их моиомерные звенья имеют конформацию *С(

Конформация молекулы целлббиозы — дисахаридного фрагмента целлюлозы (в кристалле) — стабилизуется внутримолекулярной водородной связью кислорода цикла с водородным атомом при С-3 соседнего остатка пюко иранозы

В отличие от целлюлозы, линейные молекулы амилозы имеют спиральную конформацию, причем каждый виток спирали состоит из шести a D глюко иранозильных остатков:

Данные о конформации этих остатков достаточно разноречивы.

Как показывают результаты рентгеиоструктурного анализа, в молекулах разветвленных полисахаридов — амилопектина, гликогена, декстранов — также могут встречаться кристаллические участки, если расстояние между разветвлениями цепи достаточно для образования структуры, регулярной в трех измерениях. На этих участках макромолекулы имеют линейную конформацию. Однако, как правило, для макромолекул разветвленных полисахаридов характерна сферическая форма и отсутствие квазикристаллической струк-

туры. Так, расчет пространственной структуры полнсахаридных цепей гликогена показывает, что молекула имеет спиральную конформацию, причем каждый виток спирали состоит из 5.82 глюкоз-ных остатков, а расстояние между витками спирали составляет 2,07 нм.

С отсутствием кристаллической структуры связаны такие свойства разветвленных полисахаридов, как легкая растворимость в воде при молекулярной массе порядка нескольких миллионов.

Синтез углеводов

и углеводсодержащих

биополимеров

Синтез углеводов, как правило, проводится на основе доступных природных моносахаридов. Это обусловливается широкой распространенностью в природе многих Сахаров. Полный синтез углеводов, начиная с простых химических соединений (например, глицеринового альдегида), вполне осуществим, но практического применения не находит.

Гликозидный полуацетальный гидроксил в циклических формах моносахаридов резко отличается по свойствам от остальных гид-роксилов. Индукционный эффект кислорода цикла облегчает легкий разрыв связи между С-1 и кислородным атомом группировки, находящейся при аномерном центре, и делает возможным протекание многочисленных иуклеофильных реакций при гликоэидном атоме, в том числе образование новых гликозидных связей. Реакции, приводящие к созданию гликозиднои связи, называются гликозили-рованием. Гликозилированию могут подвергаться спирты, тиолы, амины: соответственно будут образовываться О-, S- или N-гли-козидные связи.

Наиболее актуальной проблемой является стереоиаправленное создание О-гликозидной связи, т. е. гликозилирование гидрок-силсодержащих соединений, поскольку именно этот тип связи наиболее распространен в природе. Сложность таких синтезов — следствие пол и функциональности сахаров, обусловливающей необходимость защиты всех ОН-, SH- и NH-групп в молекуле гликози-лирующего агента, а также возможность образования смеси а- и р-аномеров, во многих случаях (особенно для олигосахаридов) трудноразделимой.

Синтез гликозидов

Гликозиды простейших спиртов можно получить по реакции Фишера, обрабатывая моносахариды соответствующими спиртами в присутствии кислых катализаторов. Реакция приводит к образованию смеси фураиоэндов и пиранозндов, соотношение между которыми определяется условиями синтеза.

Для получения более сложных соединений используют направленные методы создания гликозидной связи, позволяющие не только гликозилнровать любой агликон, но и задать необходимую конфигурацию связи.

481

' Синтез углеводов и углеводсодержащих биополимеров

СН2ОН

н^нои

СН2ОН

-о

Синтез олигосахаридов

В большинстве случаев синтез олигосахаридов осуществляется на основе входящих в их состав моносахаридов путем создания новых гликозидных связей. В отдельных случаях удается получать менее доступный олигосахарид из более доступного обращением конфигурации гидроксильных групп при определенных атомах или заменой гидроксила на другую функциональную группу.

В основном в качестве гликозилирующих агентов в синтезе олигосахаридов используются гликозилгалогениды-

Гликоэилгалогениды не встречаются в природе. В свободном состоянии они нестабильны, поэтому их получают в виде производных, чаще всего в виде ацетатов (а пил галогеноэ).

Ацилгалогенозы образуются при действии на моносахарид галогеноводорода в уксусной кислоте, уксусном ангидриде или ацетил хлориде. В этих условиях получается наиболее стабильный анамер. например 2,3.4,6-тетра-О-ацетил a-D-глю-коииран чилбромнд. Стабильност в данном случае определяется а номерным эферек тон: для гексоэ D-ряда предпочтительным является а-а номер.

Для синтеза нестабильных 1,2-т/хшс-ацилгалогеноз сложный эфир моносахарида (например, полный ацетат или бенэоат) обрабатывают хлоридом алюминия или четырех хлористым титаном в неполярных растворителях (бензоле, четырех-хлористом углероде)

CHiOAc

И,

О Ас

Пвнта-О-ацвти л- а-fj г л ю коп ираноэ*

СНгОН

ю4р|нон

|НВ. Ас-О CHlOAc

Jr—О

Br О Ac

Твтра-О-ацвтип-p-D— г л юкол иранозн л хлорид

Реакции ацилгалогеноэ (рис. 2581. основанные на нуклеофильном замещении атома галогена, чрезвычайно многочисленны и позволяют перейти к различным производным Сахаров: алкил- и арил! лнкоэидам. N и С-пикозидам, гл икал ям и т. д. Реакции протекают стереонаправденно, с образованием главным образом 1.2-грии< -гликозидов, однако всегда получается некоторое количество уыс-изомера. В определенных условиях конденсация 1,2-граж ацнлгвлогеноз со спиртами (в присутствии акцептора протонов — оксида серебра, третичных аминов) или ),2-цис-

482 ацилгалогеноэ (в нитрометане в присутствии 2.4.о-триметилпиридина) приводит к

- ортоэфирам сахаров. Ортоэфиры Сахаров также широко используются как проме-

Углеводы жуточные соединения в синтезе 1,2-грамс-гликоэидин и олигосахаридов. Они устой-

чивы к действию оснований, но чрезвычайно лабильны я присутствии кислых агентов.

Наиболее старым, но до настоящего времени находящим применение методом глнкоэнлнровання является метод Кёнигса — Кнорра, в котором гликозилирующим агентом служит ацилнро-

ванный a-D-гликозилгалогенид. Реакция с гидроксилсодержащим компонентом в присутствии оксида или карбоната серебра приводит к образованию 1,2-гранс-гликоэидной связи. Оксид и карбонат серебра играют двояку