Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

е аминокислоты используются для обнаружения пептидов, содержащих соответствующие аминокислотные остатки. Для идентификации гуанидиновой группы аргинина применяется реакция Сакагучи — при взаимодействии с а-нафтолом и гипохлоритом натрия гуанидины в щелочной среде дают красное окрашивание. Индольное кольцо триптофана может быть обнаружено реакцией Эрлиха — красно-фиолетовое окрашивание при реакции с п-диме-тиламинобензальдегидом в HiS04. Реакция Паули позволяет выявить остатки гистидина и тирозина, которые в щелочных растворах реагируют с диазобеизолсульфокислотой, образуя производные, окрашенные в красный цвет.

По предложению К. У. Линдерстрёма-Ланга, различают четыре уровня организации белковых молекул — первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуры. Хотя эти категории в известной степени устарели, ими пока продолжают пользоваться. Последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи называется первичной структурой. Термин «вторичная структура» относится к типу укладки полипептидных цепей. Наиболее часто встречающиеся типы — правая а-спираль, р-структура и Р-изгиб. Под третичной структурой белка понимается расположение его

полипептидиой цепи в пространстве Термин «четвертичная струк тура» относится к белкам, в состав которых входит несколько полипептидных цепей (субъединиц), не связанных между собой ковалентно; такая структура отражает характер взаимного расположения этих субъединиц в пространстве.

Первичная структура белков и пептидов

Все белки различаются по своей первичной структуре. Потенциально возможное число таких структур практически неограниченно; так, для 15 членного пептида, состоящего из различных аминокислот, существует 20' возможностей их взаимного расположения. Если же провести подобный расчет для среднего по величине белка с молекулярной массой 35 000 — 40 000, то окажется, что в живой природе все эти возможности не реализуются общее число различных типов белков у всех видов живых организмов составляет величину порядка 1010— 1012.

Познание биологической функции и, в частности, молекулярного механизма физиологического действия белка невозможно без детального знания его строения. Установление первичной структуры белка служит основой для определения вторичной и третичной структур, выяснения расположения функциональных групп в его активном центре и открывает путь к познанию механизма его функционирования. Исследование первичной структуры «мутант ных» белков позволяет на молекулярном уровне выяснить характер наследственных болезней. Данные по первичной структуре используются как один из показателей при установлении и проверке таксономических взаимоотношений между различными видами живых организмов и построении схемы биологической эволюции.

Принципиально первичную структуру белков можно определять путем непосредственного анализа аминокислотной последовательности или путем расшифровки нуклеотидной последовательности соответствующих генов с помощью генетического кода. Естественно, наибольшую надежность обеспечивает сочетание этих методов.

Исследование первичной структуры белка начинается с определения его молекулярной массы, аминокислотного состава, N и С концевых аминокислотных остатков. Поскольку пока не существует метода, позволяющего установить полную первичную структуру белка на целой молекуле, полипептидную цепь подвергают специфичному расщеплению химическими реагентами или про теолитическими ферментами. Смесь образовавшихся пептидных фрагментов разделяют и для каждого из них определяют аминокислотный состав и аминокислотную последовательность.

После того как структура всех фрагментов установлена, необходимо выяснить порядок их расположения в исходной полипептидной цепи. Для этого белок подвергают расщеплению при помощи другого агента и получают второй, отличный от первого набор пептидных фрагментов, которые разделяют и анализируют аналогичным образом.

Предположим, что исследуемый белок имеет последовательность, представленную на схеме. При действии на него трипсином гидролизуются связи Lys—Val и Arg—Ser, а при обработке бром-цианом (BrCN) расщепляются связи Met—Туг и Met—Ala.

3*

Строение белков и пептидов

Л псковский Николай Эрастоанч (1818— 1871) русский биохимик.Окончил медицинский факультет Московского университета, с 1855 г.— заведующий кафедрой химии Московского университета. Известен трудами в исследовании белков, впервые правильно установил эмпирические формулы фибрина, ¦нчного и растительного альбуминов.

Хопп Заилер (Hoppe-Seyler) Эрнст Феликс (1825—1895), немецкий биохимик. Образование получил в университетах Галле и Лейпцига (1850), с 1872 г.— профессор Страсбургского университета. Основные работы посвящены биохимии крови, изучению белков, обмена веществ. Выяснил структуру основных пигментов крови. Открыл продукт превращения гемоглобине — гемохромоген-

34 Сопоставление аминокислотных последовательностей бром-

- циановых и триптических пептидов позволяет однозначно выяснить

Белки и пептиды их расположение вдоль полипептидной цепи белка. Обычно для

определения полной структуры белка двух гидролизов оказывается недостаточно, причем чем длиннее полипептидная цепь белковой молекулы, тем большее число различных типов расщеплений белка приходится использовать.

Бромциамовые пептиды

Ale-Val-Me(l| Tyr-Ain-Lys-Val-Ile-Gly-Ser-MetlJ Ala-Phe-Arg-5ef-Glii-Vel|

JAIa-Val -Met-Tyr -Asn-LysJ Val -Ile- -Gly-Ser-Mef- -Ale- -Phe-ArgJI Ser- Clu-Vel |

Триптические пептиды |a a Va -Mel-Tyr -Asn-Lys-Val- Ile- -Gly-Ser-Mei- Ala- -Phe-Arg-Ser-Gkj-Val |

Полная аминокислотная последовательность

На завершающей стадии исследования первичной структуры белка проводится определение положения дисульфидных мостиков, если таковые имеются.

Определение аминокислотного состава

24 4В 72 96 Время гидролиза, ч

Рис. 3. Кинетика выхода некоторых аминокислот в процессе кислотного 1Идро-

Анализ аминокислотного состава включает полный кислотный гидролиз исследуемого белка или пептида с помощью 5,7 н. соляной кислоты и количественное определение всех аминокислот в гидролизате. Гидролиз образца проводится в запаянных ампулах в вакууме при 110 С в течение 24 ч. При этом полностью разрушается триптофан и частично серии, треонин, цистин и цистеин, а глутамин и аспарагин превращаются соответственно в глутаминовую и аспа-рагиновую кислоты. В то же время пептидные связи, образованные аминокислотными остатками с разветвленной боковой цепью (Val, lie. Leu), из-за стерических препятствий гидролизуются частично. Особенно стабильны связи Val—Val, Не—lie, Val—1)е и lie—Val.

С целью более надежного ппределения аминокислотного состава бетка проводится параллельный гидролиз в течение 24, 48 72 и 96 ч и все пробы далее количественно анализируются. Для валина, лейцина и изолейцина берутся максимальные значения, а для серина и треонина полученные значения экстраполируются к нулевому времени (рис. 3).

При анализе содержания в белке триптофана вместо соляной кислоты для гидролиза используется 4 н. метан ульфокислота. Триптофан можно идентифицировать спектрофотометрически И1И с помощью цветных реакции

Обычно при определении аминокис ютного состава белка ограничиваются анализом суммарного содержания глутамина и глутаминовои кислоты, аспарагина и ai_na-

paiHновой кис юты, а их дифференциации приводится в процессе установления первичной структуры. Ни теин и ни тин анализируются в вице цнетеиновой кислоты или карбоксиметн цистеина.

Количественное определение аминокислот в гидролизате белка или пептида проводится с помощью аминокислотного анализатора — прибора, разработанного в 1958 г. С. Муром и У. Стейном. Принципиальная схема анализатора приведена на рисунке 4.

Буфера А

35

Иран

На сое f-

1Гидролизат)

Нопонка I I__

|i - (Реагент) Реакционная камера <г~~~*

Фотометричесмая I 1 система | Г"

Хромато-

. грамма

Строение белков и пептидов

Мур [Moore] Ствнфорд (1913—1982), американский биохимик. Окончил университет Вандербилта (штат Теннеси, 1935), с 1952 г.— профессор Рокфеллеровского института медицинских исследований. Основные труды посвящены химии белков, установил первичную структуру панкреатической рибонуклеазы. Сконструировал аминокислотный анализатор. Лауреат Нобелевской премии по химии (1972, совместно с К Анфинсеном и У. Стейном).

Цифрован запись

Рис. 4. Схема аминокислотного анализатора.

Смесь аминокислот разделяется методом ионообменной хроматографии на колонке, заполненной сульфированной полистирольной смолой. Колонка промывается буферными растворами с последовательным повышением их рН и концентрации. Время удерживания каждой аминокислоты строго определенно и зависит от степени ее ионизации.

Выходящий из колонки элюат мешивается с ра твором нингидрина и в специальной ячейке нагревается до 10(1 С. Аминокислоты, реагируя с нингндрином,

Нингидрин

36

Белки и пептиды

превращаются в аммиак, СО и вчьдегнд. Освобождающийся аммиак взаимодействует с другой молекулой нингидрина и дает окрашенное в фиолетовый цвет производное, имеющее максимум поглощения при 570 нм. Пролин при реакции с нин-гидрином образует продукт желтого цвета (/.„„, = 440 нм). Интенсивность окраски получающихся в результате реакции продуктов, пропорциональная содержанию аминокислот в исследуемом гидролизате, измеряется с помощью спектрофотометра, показания которого регистрируются самописцем и могут поступать для обработки в миннЭВМ

В современных аминокислотных анализаторах надежно детектируется 1 нмоль аминокислоты, время анализа составляет 1,5 — 2 ч и весь процесс автоматизирован (рис. 5).

Для повышения чувствительности вместо нингидрина в ряде анализаторов применяют флуорескамин или о-фталевый альдегид.

Стейн (Stein] Уильям Хоуард (1911 — 1980), американский биохимик. Окончил Гарвардский университет (1933). с 1938 г. работал в Рокфеллеровском институте медицинских исследований ¦ Нью-Йорке- Основные труды — по исследованию строения белков. Совместно с С. Муром разработал количественный метод определения аминокислот, основанный на ионообменной хрометографии, и создал автоматический аминокислотный анализатор. Впервые установил (1960, совместно с С. Муром) первичную структуру рибо-нуклеазы. Лауреат Нобелевской премии по химии (1972, совместно с К. Анфинсеном и С. Муром).

Флуорескамин

с-СОтйлевыи альдегид

которые при реакции с аминокислотами образуют флуоресцирующие соединения. С использованием специального детектора в этом случае удается регистрировать 10 — 50 пмолей аминокислоты.

Анализ N- и С-концевых аминокислотных остатков

37

Строение белков и пептидов

В полипептидной цепи белка с одной стороны расположен аминокислотный остаток, несущий свободную а аминогруппу (амино или N-концевой остаток), а с другой — остаток со свободной ее карбоксильной группой (карбоксильный, или С-концевой остаток). Анализ концевых остатков играет важную роль в процессе определения аминокислотной последовательности белка. На первом этапе исследования он дает возможность оценить число полипептидных цепей, составляющих молекулу белка, и степень гомогенности исследуемого препарата. На последующих этапах с помощью анализа N-концевых аминокислотных остатков осуществляется контроль за процессом разделения пептидных фрагментов.

Один из первых методов определения N-концевых аминокислотных остатков был предложен Ф. Сенгером в 1945 г. При реакции а-аминогруппы пептида или белка с 2, 4-динитрофторбензолом получается Оинитрофенильное (ДНФ) производное, окрашенное в желтый цвет. Последующий кислотный гидролиз (5,7 н. НС1) приводит к разрыву пептидных связей и образованию ДНФ проиэвод ного N-концевой аминокислоты. ДНФ-Аминокислота экстрагируется эфиром и идентифицируется методом тонкослойной хроматографии в присутствии стандартов.

NG2 I

Сенгер (Sanger) Фредернк (p. 1918), английский биохимик. Окончил Кембриджский университет (1939); с 1951 г. руководил отделом химии белка Медицинского исследовательского совета и одновременно с 1954 г.— лабораторией молекулярной биологии Кембриджского университета. Разработал основные методы исследования первичной структуры белков, установил химическое строение инсулина. Предложил эффективный метод определения нуклеотидной последовательности в полидезоксирибонуклео ид х Лауреат Нобелевских премий по химии (1958; 1980, совместно с У. Гилбертом и П. Бергом).

0„1Ч

0,1Ч

Наибольшее применение для определения N-концевых остатков в настоящее время находит разработанный в 1963 г. В. Греем и Б. Хартли дане ильный метод. Как и метод динитрофенилирования, он основан на введении в аминогруппы белка «метки», ие удаляющейся при последующем гидролизе. Его первая стадия — реакция дансилхлорида (1-диметиламинонафталин-5-сульфохлорида) с не-протонированной а амино руппои пептида или белка с образованием дансилпептида (ДНС-пептида).

38

Белки и пептиды

Хартли (Hartley] БрамеН (р. 1926), английский биохимик. Окончил университет в Лидсе (1947), с 1981 г.— директор Центра биотехнологии Лондонского университета. Известен работами по химии пептидов и белков, разработал (совместно с В. Греем) дансильный метод определения N-концевых аминокислотных остатков.

На следующей стадии ДНС-пептид гидролизуется (5,7 н. НС1, 105 "С, 12 — 16 ч) и освобождается N-концевая а-ДНС-амино-кислота. Кроме того, в результате дансилирования боковых групп остатков лизина и тирозина могут получаться е-ДНС-лизин и О-ДНС-тирозин.

ДНС-Аминокислоты обладают интенсивной флуоресценцией в ультрафиолетовой области спектра (fc.BOl6_ — 365 нм); обычно для их идентификации достаточно 0,1 — 0.5 имоль вещества.

Некоторые ограничения даней чьного метода связаны с использованием достаточно жесткого кислотного гидролиза; при этом имеет место разрушение остатков триптофана и дезаминирование остатков аспарагина и глутамина- В то же время связи, образованные остатками валина и изолейцина типа ДНС—Не—Val—, ДНС - Val—lie— и т. п.. обладают повышенной устойчивостью к гидролизу, в результате чего наряду с ДНС-аминокислотами образуются ДНС-дипептиды, что осложняет идентификацию. В этом Случае целесообразно увеличить продолжительность гидролиза до 2 — 3 суток. С другой стороны, для повышения выхода лабильных ДНС-серина, ДНС-треонина и ДНС-пролина следует сократить время гидролиза до 4 ч.

Долгое время единственным методом идентификации ДНС-ами-нокислот являлся метод микротонкослойной хроматографии. Были предложены разнообразные системы для разделения ДНС-амино-кислот с помощью одномерной и двумерной хроматографии на тонких слоях целлюлозы, силикагеля (рис. 6) и полиамида. Однако сейчас более перспективным методом идентификации ДНС-амнно-кислот становится высокоэффективная обрат нофа зова я жидкостная хроматография с использованием флуоресцентного детектора, позволившая повысить чувствительность дансильного метода до уровня 10 пмолей (рис. 7. 8).

Имеется ряд методов, с помощью которых можно определять как N концевой аминокислотный остаток, так и N концевую аминокислотную последовательность. К ним относятся деградация по методу Эдмана и ферментативный ги

страница 6
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(30.04.2017)