Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

синтеза чужеродных белков в дрожжевых клетках. Такие клетки, подобно В. subtilis, секретируют значительное количество белков во внеклеточную среду, что используют также для секреции чужеродных белков. С этой целью к эгспрессируемому гену присоединяется участок, коднруюший сигнальный пептид, обу ело вливающий секрецию и отщепляемый в ее процессе. В результате в клетке синтезируется белок, содержащий на N конце сигнальный пептид. Этот белок секретируется в окружающую среду. Таким образом были получены, например, штаммы дрожжей, секретирующие интерферон человека.

Клонирование в клетках животных. Проблема клонирования в клетках животных имеет большое значение для исследования функционирования генов высших эукариот. Предварительно клонированные гены вводят в клетку животных различными путями. Один из путей включает в себя кон-трансформацию клеток требуемым геном, соединенным с одним из генов, для которых осуществляется селекция. Примером являются клетки мыши, дефектные по синтезу тимидинкиназы (ТК -клетки). Клетки трансформируются фрагментами ДНК вируса герпеса (HSV), содержащего ген тимидинкиназы, и после трансформации приобретают способность к синтезу фермента, т. е. становятся ТК ^-клетками. Клетки ТК+ легко отличаются от ТК , поскольку они способны расти на средах с ами-

ноптерином (блокирующим определенные стадии биосинтеза нуклеотидов). гипоксантином и тимидииом.

Следовательно, при конструировании ^трансформирующих векторов для трансформации клеток животных используются гибриды бактериальных плазмид с геиом ТК из вируса герпеса. Предварительно клонирование и идентификация генов проводятся в клетках Е. coli и затем рекомбинантная плазмида вводится в ТК -клетки. Среди образовавшихся ТК г -трансформантов отбираются нужные, например путем идентификации продуктов экспрессии клонированных геиов.

Другой путь введения клонированных геиов в эукариотиче-ские клетки аналогичен применяемому в случае Е. coli, когда в качестве векторов используют бактериофаги. В качестве таких эукариотических векторов служат некоторые вирусы. Во многих из них существуют области для литического роств, которые могут быть заменены на чужеродные ДНК. Такие вирусы реплицируются в клетке-хозяине, экспрессируя чужеродные гены. Однако в вирусах животных размеры несущественных областей малы и ие позволяют внедрить большие фрагменты ДНК. Некоторые гены животных имеют большие размеры (например, ген дигидрофолатредуктазы мыши — 42 тыс. п. о.). В большинстве случаев чужеродивя ДНК замещает существенные гены, в результате чего рекомбинантные вирусы теряют способность к репликации. Для ее обеспечения используют вирусы-помощники, синтезирующие продукты недостающих генов. В присутствии помощников рекомбинантиый вирус существует за счет этих продуктов. Примером вирусов, применяемых в качестве векторов, является вирус SV-40, геном которого представляет собой циклическую ДНК длиной 5243 п. о. с полиостью известной последовательностью. Эукариотические векторы, использующие вирусы, способные формировать вирионы, обладают тем недостатком, что они убивают клетку-хозяина при своем размножении (так же как и бактериофаги). Поэтому постоянно делаются попытки разработать векторы, подобные плазмидам. Обычно опухолевые вирусы, в том числе и SV 40 внедряют свою ДНК в хромосому клетки-хозяина. Однако вирус бычьей папилломы в трансформированных клетках существует в виде эписомы (около 100 копий на клетку) и используется в качестве основы для создания эписомиых векторов.

Высокий темп исследований генной инженерии на клетках животных вселяет надежду, что в ближайшее время будут разработаны простые системы, которые позволят осуществить анализ механизмов экспрессии генов эукариот и дадут возможность создать животных, обладающих заданными свойствами.

Генная инженерия растений. Эта отрасль генной инженерии не так хорошо разработана, как в случае животных и тем более микробных клеток. Однако в настоящее время она привлекает очень большое внимание, поскольку открывает новые перспективы в растениеводстве. Обычная селекция новых сортов — процесс медленный, и кроме того, она ограничена природными видовыми барьерами. Введение новых генов с помощью техники рекомбинантных ДНК в растения могло бы ускорить этот процесс и существенно расширить его возможности. Кроме того растения обладают существенной особенностью: целое растение может быть выращено из отдельной клетки. Это не относится в равной степени ко всем растениям, например, клетки злаковых или бобовых только очень редко претерпевают такую редифференциацию, тогда как клетки табака, томата или моркови, как показала практика, подвергаются редифферен-циации сравнительно легко.

При растворении целлюлозной стенки растительной клетки ферментами-целлюлазами образуются протопласты, в которые

442

Нуклеиновые кислоты

Рис. 257. Физическая карта нспалн новой Ti-плазмиды. Гены One ответственны за онкогенность, ген Noc — за синтез нопалниа, ген Arc — за деградацию аргинина.

легко проникают макромолекулы, в том числе ДНК. Две различные клетки в виде протопластов соединяются с образованием гибридного протопласта (соматической гибридной клетки). Протопласты способны восстанавливать клеточную стенку и далее давать целое растение. Растение может быть получено из протопластов, включивших чужеродную ДНК, или из гибридных протопластов.

При наличии методов введения в растительные клетки определенных генов, способных к функционированию и стабильному наследованию, открываются реальные возможности создания растений с заранее заданными полезными признаками. Векторы для введения генов в растительные клетки могут быть основаны на репликоиах растительных вирусов, однако до настоящего времени попытки получения таких векторов, удовлетворяющих, в частности, требованию стабильного наследования, были не очень успешны.

Наибольшее развитие тюлучили векторы, сконструированные на так называемых Ti плазмидах бактерий Agrobaclerium tumefaciens Эти бактерии инфицируют двудольные растения и вызывают образование корончатых галлов — своеобразных опухолей растений, клетки которых способны размножаться в культуре без добавления факторов роста. Было показано, что такая трансформация является следствием внедрения в геном растения части ДНК-ТЦштог-inducing)-плазмиды, получившей название Т (transforming)-flHK. Трансформированные клетки приобретают способность синтезировать необычные аминокислоты — опины, например, иопалин или октопин, являющиеся производными аргинина и служащие источником питания A. tumefaciens. Какая именно аминокислота синтезируется, зависит от Ti-плазмиды, трансформировавшей клетку: одни бактерии A. tumefaciens несут октопиновые, а другие — нопа линовые плазмиды. И опухолевая трансформация, и синтез опинов вызваны Т-ДНК. В Т-ДНК содержится несколько генов, контролируемых отдельными промоторами, которые и определяют все свойства опухолевых клеток. Трансформация клеток Т-ДНК стабильно наследуется; некоторые трансформированные культуры существуют без изменения уже более 20 лет. Интегрированная Т-ДНК наследуется по законам Г. Менделя.

Ti Плазмиды способны трансформировать практически все двудольные растения, что делает их перспективным вектором для введения чужеродных ДНК в растения (рис. 257).

К сожалению, трансформированные Т-ДНК клетки не способны давать растения. Однако были получены мутанты Т-ДНК, трансформирующие растительные клетки и не подавляющие их способности превращаться в растение. Внедрение чужеродных генов в Т-ДНК, под контроль промоторов, способных функционировать в растении, которое может быть осуществлено с помощью специально сконструированных векторов, дает возможность включать их в геном растительных клеток и получать растения, содержащие новую генетическую информацию.

Для улучшения свойств сельскохозяйственных растений необходимо внедрение в них такой генетической информации, которая делала бы их устойчивыми к засухе, заморозкам, позволяла расти на засоленных почвах, придавала способность фиксировать азот и устойчивость к сельскохозяйственным вредителям. Это осуществляют переносом соответствующих генов из растений, обладающих подобными свойствами. Так, в качестве примера можно привести создание петунии (Petunia) или табака (Nicotiana tabacum), устойчивых к гербициду глифосату, путем введения в клетки растений гена, дающего резистентный к этому веществу грермент. Полученные клетки были затем превращены в целые растения. Внедрение полезной генетической информации осуществлено с помощью П-плаз-миды.

УГЛЕВОДЫ

Строение углеводов и углеводсодержащих биополимеров

Синтез углеводов

и углеводсодержащих

биополимеров

Отдельные представители углеводов и углеводсодержащих биополимеров

Углеводы

Колли Апеисаидр Андреевич

((840—1916], русский химик-органик. Окончил Московский университет (1860), в 1876—1903 гг.— профессор Московского Высшего технического училища- Основные работы—в области химии углеводов. Одним из первых установил строение глюкозы (1870). Первым синтезировал дислха-риды (1879).

Углеводы относятся к числу наиболее распространенных в природе органических соединений: они являются компонентами клеток любых организмов, в том числе бактерий, растений и животных. Среди них встречаются как достаточно простые соединения с молекулярной массой около 200, так и гигантские полимеры, молекулярная масса которых составляет несколько миллионов. Углеводы появляются в растениях уже иа ранних стадиях превращения углекислого газа в органические соединения в процессе фотосинтеза. Животные не способны сами синтезировать углеводы из углекислого газа и поэтому полностью зависят от растений как их поставщиков.

Функции углеводов в клетках весьма разнообразны. Они служат источником и аккумулятором энергии клеток (крахмал, гликоген), выполняют скелетные функции в растениях и некоторых животных, например в крабах, кревеУках, служат основой клеточной стенки бактерий, входят в состав некоторых антибиотиков. Большинство животных белков имеют детерминанты углеводной природы, являясь гликопротеинами. Нельзя забывать и о том, что углеводы D-рибоза и D дезоксирибоза — одни из главных компонентов нуклеиновых кислот. В последние годы большое внимание привлекают функции углеводов как рецепторов клеточной поверхности и антигенных детерминант природных биополимеров.

Исторический очерк. Еще в древние века человечество познакомилось с углеводами и научилось использовать нх в практической деятельности. Хлопок, древесина, лен, тростниковый сахар, мед, крахмал — это лишь некоторые из углеводов, сыгравшие важную роль в развитии цивилизации.

В индивидуальном виде первые моносахариды — глюкоза и фруктоза — были выделены в конце XVIII — начале XIX века, однако установление их структуры стало возможным лишь с развитием учения о строении органических соединений. Определение элементного состава глюкозы, фруктозы, маниозы и других углеводов показало, что они имеют общую формулу С„(НуО)„, т. е. как бы состоят из углерода и воды; отсюда углеводы и получили свое название.

Р. Фиттиг и А. Байер первыми предложили в 1868 — 1870 гг. правильную формулу глюкозы, однако оставалось неясным, каким образом моносахариды, имеющие идентичную формулу, могут различаться по физико-химическим свойствам. Это противоречие удалось разрешить Э. Фишеру с помощью стереохимических представлений Я. Г. Вант-Гоффа: он определил относительную конфигурацию ряда моносахаридов (глюкозы, фруктозы, маннозы, араби-нозы), что заложило основу современной химии углеводов. Многие свойства моносахаридов тем не менее оставались необъяс не иными. В частности, число изомерных моносахаридов и их производных было вдвое больше, чем следовало из положений стереохнмической теории, что свидетельствовало о наличии дополнительного асимметрического атома углерода. А. А. Колли объяснил этот парадокс образованием оксидного цикла за счет альдегидной группы и одного из гидроксилов, однако размер цикла — трехчленный — был предсказан им неправильно. Экспериментальное доказательство размера лактольного кольца было получено лишь в 20-х годах нашего века У. Хеуорсом, применившим для решения задачи метод метилирования.

Одновременно было начато изучение строения полисахаридов, что также стало возможным благодаря работам У. Хеуорса. Полисахариды, входящие в состав растений, бактерий и животных тканей, надолго привлекли внимание исследователей. Бактериальные полисахариды, образующие основные антигенные детерми иаиты бактерий и определяющие их серотип, и до настоящего време-

ни вызывают повышенный интерес прежде всего в плане получения вакцин к патогенным бактериям.

В дальнейшем внимание исстедоватезей было привлечено к изучению углеводсодержащих смешанных биополимеров — гликопротеинов, гликолипидов, ротео ли канов и т. д., которые составляют основу клеток и жидкостей животных ор.анизм в и играют ключевую роль в процессах жизнедеятельности. Долгое время считалось, что высокомолекулярные углеводы представляют собой энергетический резерв клетки и не имеют никаких других существенных биологических функций. Отношение к гликоконъюгатам резко изменилось после того, как в 1969 г. обнаружилось, что опухолевая трансформация животных клеток приводит к заметному изменению спектра гликопротеинов и гликолипидов клеточных мембран. Стало очевидным, что такие изменении могут играть по 1Ь в распознавании опухолевых клеток иммунной системой организма и в метастазнровании Возникло более общее предположение, что углеводные детерминанты гликоконъюгатов клеточной поверхности участвуют в межклеточном узнавании. Эти гипотезы стимулировали изучение структуры углеводных цепей гликоконъю! атов, и заметные успехи были достигнуты в 70 — 80-е годы благодаря работам А. Кобаты, С. Корнфельда. С.-И. Хакомори и др. Сложность задачи потребовала привлечения всего арсенала химических, биохимических и физико-химических методов анализа. Среди исследованных гликопротеинов — групповые вещества крови, иммуноглобулины, компоненты системы комплемента, 1и опротеины мембран животных клеток.

Важную роль в понимании химических свойств Сахаров, особенно их циклических форм, сыграло развитие учения о конформациях молекул. Основополагающими стали работы, выполненные в 50-е годы Р. Лемье. Действенным инструментом изучения конформации Сахаров в растворе становится ядерный магнитный резонанс. Многочисленные данные накоплены о конформациях Сахаров в кристаллах с помощью рентгеноструктуриого анализа, который успешно используется и при исследовании пространствеииой структуры углеводсодержащих биополимеров.

В 50-е годы работами Л. Лелуара, обнаружившего уридиндифос-фатглюкозу, а позднее полипренильные производные Сахаров, было положено начало изучению процесса биосинтеза углеводных цепей углеводсодержащих биополимеров.

Большой путь прошла и синтетическая химия углеводов. Полный синтез моносахаридов (глюкозы, маннозы и фруктозы), осуществленный еще в конце XIX в. Э. Фишером, в настоящее время не находит применения — гораздо легче получить моносахариды из природных источников. В те же годы Э. Фишером был разработан метод получения гликозидов про

страница 59
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.08.2017)