Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

тт

Одноиелочечная нДнН с 1111

Фрагмент Кленова '.cNTP

д укцеп чечнан нДНН Г

^ 5,-иуклеаза

ДВу,цепочеч„а„»ДНН I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ПТ

При соединение линкеров EcoRI

Присоединение коннекторов nonntdA)

Рис. 252. Схема подготовки кДНК для клонирования.

mi.......

EcoRI ААААА

Встраивание в вектор,

расщепленный EcoRI

.....шиш......г

Встраивание в вектор с коннекторами поли(dT)

Клонирование при использовании в качестве векторов бакте- 435

рнофага л осуществляется следующим образом: к суспензии бак- -

терий, обработанных СаСГ., добавляется ДНК фага и осуществляет- Генная инженерия

ся посев на чашку Петри с питательным агаром так, чтобы на 1 см2 поверхности попадало 5 — 10 клеток с проникшей в них ДНК фага. Клетки, не содержащие ДНК фага, размножаются на агаре и дают мутный ровный «газон», заполняющий всю поверх ность чашки. Однако в тех точках, куда попали бактерии с ДНК фага, остаются прозрачные круглые просветы, называемые бляшками или негативными колониями. Образование бляшек связано с тем, что ДНК фага реплицируется в клетке и дает зрелые фаговые частицы. Затем фаговые частицы попадают в среду, заражают окружающие клетки и разрушают их. В результате каждая бляшка состоит из потомков фагов, содержащих одну и. ту же ДНК — копию ДНК, попавшей в клетку.

Фаги типа М13 не дают негативных колоний, поскольку оии не разрушают клетки. Однако в месте их размножения клетки Е. coli замедляют деление, что приводит к появлению на общем мутном газоне более прозрачных бляшек. Способы селекции осиоваиы либо на том, что в несущественную область фага (МП) вводят ген, программирующий устойчивость к антибиотикам и разрушающийся при внедрении в него чужеродной ДНК, либо иа различии цветных реакций, даваемых клетками, зараженными исходным и рекомби-наитным фагами.

Получение ДНК для клонирования. ДНК для клонирования может быть получена химико-ферментативным синтезом, обратной

Денатурированная ДНН. иммобили зованная на фильтрах- реплинах

Гибридизация с радиоактивной пробой и радио-аатсгряфип

После радиоавтографии участки рентгеновской пленки, соприкасавшиеся с точками, где были расположены требуемые ре ном бинантные клоны, оказываются засвеченными.

Рнс. 253. Метод радиоавтографы и в применении к поиску рекомбинантных кло-

транскрипцией мРНК или путем непосредственного расщепления геномной ДНК нужной рестрикциоииой эндонуклеаэой.

При обратной транскрипции эукариотической мРНК чаще всего используется тот факт, что на ее З'-конце обычно содержится поли (А) последовательность, благодаря которой в качестве затравки для обратной транскрипции можно применять олиго (dT). На первой стадии обратная траискриптаза синтезирует одноцепочеч-ную ДНК, комплементарную мРНК. Эта ДНК обычно содержит иа З'-конце «шпильку». После удаления РНК обработкой щелочью или РНКазами образуемая одноцепочечиая ДНК служит затравкой-матрицей для фрагмента Кленова ДНК-полнмеразы I, который при наличии четырех dNTP достраивает вторую цепь. В результате образуется шпилечная структура, превращаемая в истинную двух-цепочечную кДНК обработкой S нуклеазой (рис. 252).

Далее полученную кДНК можно встроить в соответствующий вектор с помощью линкеров или коннекторной техники.

Идентификация клонов. Если вставка содержит геиы, способные к экспрессии в новом хозяине, рекомбинантные клоны могут быть идентифицированы по синтезируемому ими продукту. Однако чаще приходится идентифицировать непосредственно нуклеотидную вставку, для чего используют методы гибридизации. Бактериальные (или фаговые) колонии выращиваются на нитроцеллюлозных фильтрах, помещенных на чашку Петри с питательной средой (рис. 253). После этого приготавливаются так называемые репли кн — к фильтру с исходными колониями прижимается свежий нитроцеллюлозный фильтр, который затем переносится на чашку Петри с плотной питательной средой, где на нем образуются колонии, идентичные первым.

Далее фильтр-реплику подвергают щелочной обработке, клетки в колониях подвергаются лизированию, и денатурированная ДНК из клеток связывается с нитроцеллюлозой в том месте, где была расположена соответствующая колония. Если в распоряжении исследователя имеется радиоактивная ( Р- или '^'1-меченная) ДНК или РНК, комплементарная требуемой вставке, то при выдерживании фильтра в растворе, содержащем радиоактивный полинук-леотид, последний гибридизуется с комплементарными последовательностями. В результате те части фильтра, в которых находились рекомбинантные клоны с требуемой встаакой, оказываются радиоактивными и идентифицируются ради о автографически.

Радиоактивные «пробы» получают химическим синтезом (в тех случаях, когда известна последовательность искомой вставки или белка, который она кодирует), выделением индивидуальных или сильно обогащенных мРНК с последующим их иодированием ,251, а также ферментативным синтезом соответствующих кДНК с использованием ''Р-мечеиык дезоксирибоиуклеоэидтрифосфатов.

Проблемы экспрессии чужеродных генов

При включении бактериальных генов вместе с их регуляторными участками в Е. coli они, как правило, экс пресен руются, давая мРНК и белок. Это происходит потому, что в сигнальных последовательностях, управляющих транскрипцией и трансляцией в различных прокариотических организмах, много общего. Однако экспрессия генов эукариот в бактериях наблюдается очень редко, если не создавать специальные условия. Регуляторные сигналы эукариот сильно отличаются от регуляторных сигналов бактерий

и не узнаются бактериальными РНК-полимераза ми и рибосомами. 437

При клонировании не кДНК, а геномной ДНК эукариотической -

клетки экспрессия не происходит, поскольку в бактериальной клетке Геиная инженерия

отсутствует система «сплайсинга».

Поэтому для осуществления экспрессии эукариоти чес кого гена соответствующая кДНК или синтетическая ДНК, содержащая кодирующую последовательность, присоединяется в составе векторной молекулы к регуляторным элементам бактерии — промотору и рибосом-связывающему участку.

Иногда присоединение ведется таким образом, что кодирующая часть зукариотического гена присоединяется к кодирующей части бактериального гена так, чтобы сохранялась «рамка» считывания. В последнем случае образуются гибридные белки, содержащие в N-концевой части бактериальный белок или его часть, а в С-концевой части — эукариоти чес кий белок. Примером использования такого способа экспрессии является получение гормона соматостатина в клетках Е. coli (К. Итакура, Г. Бойер) (см. с. 267f. Аминокислотная последовательность гормона известна, и исходя из нее, согласно генетическому коду, была выведена структура соответствующего искусственного гена. Осуществлен его синтез: ген содержал на N-конце кодон ATG, кодирующий метионин, и липкий * конец, соответствующий расщеплению рестриктаэой EcoRI ААТТ, а иа С-конце — два стоп-кодона (рис. 254). Этот фрагмент ДНК был присоединен к фрагменту гена р-галактозидазы Е. coli, содержащему в С-концевой части участок расщепления EcoRI, и вместе со своим промотором и оператором был встроен в плазмиду pBR322 В результате такого соединения получен гибридный ген, в котором С-концевая часть геиа р-галактозидазы заменена «геном» соматостатина. Между геном р галактозидазы и собственно геном соматостатина находится кодон метионина. Транскрипция и трансляция этого гибрида осуществлялась за счет использования соответствующих сигнальных последовательностей Р-галактозидазы. В результате образовался химерный белок, а котором соматостатин отделен от р галактозидазнои части остатком метионина. Поскольку СОМаТОСТаТИН ие СОДерЖИТ МеТИОНИНОВЫХ OCTaTKOB, ТО ПрИ рас- рис. 254. Получение соматостатина через

щеплении химерного белка бром цианом соматостатин был отделен гибридный белок с р галакто идазой.

С

ДНК гена р* — галактозидазы Ген сом остатинл

I Р I ° I -f ААТТС"ГаТСГ1 GCT GGT TGT A AG AAC ТТС TTT TG

Е coRi ~J

Гибридный белок

pBR3 Плазмидная ДНК

-JC TAGJ GAT AGT | TGT GCT TCA CTT TCA G ^> \

p— Г.ЛЙНТО-

зидазе

Смнгеэ in vivo

-Met-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe ¦

S i

Phe. Trp Lys

HO-Cys-Ser-Thr-Phe-Thr -

In vitro расщепление Br к (i-Gal-фрагмемты + NHo-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe -

j Phe-i Trp i Lys HO-Cys- Ser-Thr-Phe-Thr"

Активный сома.ос.а.ин

438 в виде целого пептида. Такой способ экспрессии используется,

- когда возможно отщепление экспрессируемого пептида от N-koh-

Нуклеиновые кислоты цевой части химерного белка или когда достаточно получить гиб-

ридный полипептид, например в случае получения искусственных вакцин, где достаточно наличия необходимых антигенных детерминант.

Рис. 255. Схема расположения элементов цля прямом экспрессии чужеродных генов в новом хозяине.

5D

Кодирующая часть

Для получения белков' содержащих более 150 аминокислот, чаще используется прямая экспрессия соответствующих генов, в результате которой сразу синтезируются требуемые белки лишь с незначительной модификацией. При этом кодирующая часть гена соединяется с бактериальным промотором, рибо соме вяз ывающим участком и инициирующим кодоном ATG (рис., 255).

Именно таким образом получены штаммы Е. coli, продуцирующие гормон роста человека, интерфероны человека и другие белки, имеющие большое практическое значение. Присоединение к кодирующей части гена инициирующего кодона необходимо для обеспечения инициации трансляции. Это приводит к тому, что

Нопонии на Диск с сорбирован- Нонтантдисна

чашке Петри ными антителами с нолониями

Рис. 256. Схема, демонстрирующая им-мунохимическую идентификацию экс-прессирующих клонов.

Диск после контакта, содержащий в некоторых участках комплекс антиген-антитело

Посадна метни в месте первого комплекса антиген-анти тел о

N-кинцевая часть синтезируемых таким способом полипептидов отличается от природных присутствием N-концевого формилметионина. Ферменты процессинга бактериальной клетки частично удаляют ее, однако часть синтезируемого белка все же сохраняет модификацию. Во многих случаях такая модификация не меняет физиологических свойств продукта, но при получении лекарственных препаратов необходимо учитывать возможный ее эффект.

Идентификация экспрессирующих рекомбииантных клонов. ^1е тод идентификации экспрессирующих клонов зависит от свойств продукта экспрессии. Если этот продукт обладает собственной биологической активностью, то он может быть идентифицирован по ее проявлению. Например, если экспрессии подвергается ген, кодирующий фермент, то клоны идентифицируют по наличию в них соответствующей ферментативной активности; клоны, синтезирующие интерферон,— по противовирусной активности клеточных экстрактоа и т. д.

Однако наиболее общими являются методы и мму но химического анализа, применимые как в случае прямой экспрессии, так и при синтезе гибридных белков.

Существует много вариантов иммунохимического анализа. Одни из наиболее распространенных заключается а следующем. На диске из поливннилхлорида сорбируются немеченые антитела к исследуемому белку. Колонии прямо иа чашке Петри лизируются в мягких условиях, и поливинилхлоридный диск вводится в контакт с поверхностью чашки. Продукты с антигенными детерминантами исходного белка образуют комплексы антиген — антитело с антителами, сорбированными на диске только в местах положения экспрессирующих клонов. Затем диск отмывается от иеспецифи-чески сорбированного антигена и обрабатывается раствором с меченными (радиоактивно, флуоресцентно илн иммуноферментно) антителами. Эти антитела образуют комплекс с антигеном за счет его других антигенных детерминант, в результате чего участки диска, содержащие первый комплекс антиген — антитело, оказываются мечеными (рис. 256). По положению меченых участков на диске легко идентифицировать экспрессирующие колонии.

Клонирование в различных организмах

В настоящее время разработаны системы клонирования в различных бактериях, дрожжах, грибах, растениях и млекопитающих. Наибольший интерес с практической точки зрения представляют системы клонирования в грамположительных бактериях, многие из которых являются промышленно используемыми, а также в дрожжах и клетках высших организмов.

Обычно векторы для клонирования в таких системах представляют собой двойные репликоны, которые могут существоаать и в Е coli, и в той клетке-хозяине, для которой они предназначены. Это достигается созданием гибридных векторов, содержащих репликон какой-либо из плазмид Е. coli и требуемый репликон, например плазмиды В. subtilis или дрожжей, что позволяет проводить первоначальное клонирование и отбор требуемых генов в хорошо изученной системе Е. coli, а затем уже вводить выделенные рекомби-нантные плазмиды в новый организм.

Такие векторы должны содержать в себе ген или гены, придаю щие клетке-хозяину легко тестируемый признак, например устойчивость к антибиотикам.

Клонирование в грамположительных бактериях. Наиболее широко используются методы клонирования в В. subtilis и стрептоми-цетах Разработка систем векторов для В. subtilis основана на способности плазмнд Staphylococcus aureus, несущих гены устойчивости к антибиотикам, к репликации и стабильному наследованию в сенной палочке. Для зтих целей гибриды таких плазмид с плазми-дами Е. coli широко используются в качестве векторов для В. subtilis. Рекомбинантные штаммы несут признаки устойчивости к аитибно тикам.

Стрептомицеты широко применяются в биотехнологии в качестве продуцентов антибиотиков. Конструирование векторов для клонирования в них началось с выделения плазмиды Scp2 из Strepto-myces coelicolor. На основе этой и подобных плазмид в настоящее время сконструированы векторы, придающие стрептомицетам устойчивость, например, к таким антибиотикам, как метиленоми-цин Д.

Клонирование в дрожжах. Наиболее широко используются штаммы Saccharomyces cerevisiae. Работа с дрожжами облегчается тем, что. подобно бактериям, они могут расти в жидкой среде и давать колонии на твердой, генетически хорошо, охарактеризованы и имеют сравнительно короткое время генерации. S. cerevisiae содержит плазмиду Scpl представляющую собой циклическую молекулу длиной 2 мкм. Ее гибриды с плазмидами Е. coli обычно и используют в качестве векторов. Селекция дрожжевых клонов, трансформированных такими рекомбинантиыми плазмидами, осиоваиа на применении в качестве клеток-хозяев определенных мутантов, не способных расти на среде, лишенной какого-либо питательного компонента. Векторная плазмида, в свою очередь, содержит ген или гены, которые при попадании в клетку придают ей этот недостающий признак. Трансформаиты легко отбираются по их способности давать колонии на обедненной среде.

Поскольку дрожжи представляют собой эукариотический организм, можно было бы ожидать, что гены различных эукариот, в том числе и те, которые содержат нитроны, будут корректно экспрессироваться в дрожжевых клетках. Однако это не так. Например, экспрессия генов [i глобина кролика в дрожжах не происходит благодаря некорректности транскрипции и последующего «сплайсинга» РНК. Тем не менее, применяя приемы, аналогичные использовавшимся при клонировании в бактериях, удается достичь

страница 58
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(27.04.2017)