Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

на. Несомненно, в этом процессе участвуют и другие элементы структуры мРНК. Существуют серьезные доводы в пользу того, что большую роль играет здесь вторичная структура мРНК.

Последовательность, аналогичная Шайна — Дальгарно, как правило, отсутствует в эукариотических мРНК. Эукариотические матрицы моноцис ронны и содержат на 5'-коице «кэп»-структуру, узнаваемую одним из факторов инициации эукариотической трансляции. Предполагается, что малая 40S субчастица рибосом связывается непосредственно на 5'-конце мРНК и как бы «едет» по ией в 3 направлении до тех пор, пока не встретится первый AUG кодон. который в большинстве случаев и является инициирующим. Далее происходит присоединение 60S субчастицы, сборка полного ииициаторного комплекса и начинается синтез полипептидной цепи. Эта так называемая «сканирующая модель» инициации трансляции у эукариот была предложена несколько лет назад М. Козак. Однако даже в этом случае инициирующий кодой, как было показано путем анализа известных 5'-концевых структур эукариотических матриц, находится в особом окружении, которое, по-видимому, и является сигналом остановки малой субчастицы и начала сборки полной транслирующей рибосомы.

Элонгация, в свою очередь, состоит из трех основных стадий: связывание аминоацил тРНК образование пептидной связи и транслокация (рис. 242). В рибосоме условно выделяют два функ-

циональных центра — А-центр, в который помещается каждая вновь вступающая в реакцию аминоацнл РНК и Р цен р в котором располагается тРНК с присоединенной к ией растущей пептидной цепью (пептидил-тР НК). Фактор элонгации EF-Tu образует комплекс с GTP, который, в свою очередь, взаимодействует с аминоацил-тРНК с образованием тройного комплекса. Комплекс связывается с рибосомой, так что аминоацил-тРНК оказывается в А-центре, и ее антикодон образует комплементарный комплекс с кодоном мРНК. При этом происходит гидролиз GTP и комплекс Tu-GDP отделяется от рибосомы. В результате аминоацил-тРНК в А-центре располагается рядом с пептидил-тРНК, которая находится в Р центре и взаимодействует с предыдущим кодоном. Фермент пептидилтрансфераза, являющийся структурной частью SOS субчастицы, переносит пептидную цепь на новую аминокислоту, в результате чего вновь вошедшая аминоацил tPHK превращается в пептидил-тРНК, а прежняя пептидил-тРНК оказывается незаряженной (рис. 242).

После этого происходит транслокация: новая пептидил-тРНК перемещается в Р-центр, незаряженная тРНК отделяется от рибосомы, рибосома передвигается по мРНК на одни триплет и в А-центре оказывается следующий кодон мРНК. Рибосома готова к приему следующей амииоацнл тРНК Транслокация катализируется фактором EF-G.

425

Процессы с участием нуклеиновых кислот: репликация, транскрипция и трансляция

Рис. 242. Стадии элонгации. Синтез первой пептидной связи: / - EF-Tu — зависимое связывание миноацнт тРНК с А-участком рибосомы;

2 — пептнднлтрансферазная реакция;

3 — EF-G зависимая тракслокация.

426

Терминация

Нуклеиновые кислоты

Наконец, последняя стадия — терминация осуществляется, когда рибосома достигает терминирующего кодона — UAA, UAG или UGA, который оказывается в А-центре. В этой ситуации к рибосоме

Рис. 243. Терминация белкового син- присоединяется один из RF-факторов, в результате чего происходит

гидролиз сложноэфирной связи, соединяющей полипептид и тРНК. От пептидил-тРНК отщепляется готовая белковая цепь, незаряженная тРНК покидает рибосому, н процесс трансляции завершается (рис. 243).

Генная инженерия

Генная инженерия, или техника рекомбинантиых ДНК,— это совокупность приемов, позволяющих путем операций in vitro перенести генетический материал из одного организма (который принято называть источником генов) в другой (называемый хозяином или реципиентом) таким образом, чтобы обеспечить наследование этих генов в новом для них организме. Перенос генов методами генной инженерии дает возможность преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим (например, от человека или животного — бактерии и т. п.). В генной инженерии широко используются подходы и методы биоорганической химии.

В самом общем виде принцип генной инженерии изображен на рисунке 244. В какой-либо из заранее выделенных репликонов хозяина вводят in vitro нужный ген из другого источника. Полученную таким образом рекомбинантную молекулу, сохраняющую

свойства репликоиа, снова внедряют в клетку-хозяина, в которой 427

он будет реплицироваться и стабильно передаваться клеткам-по- -

томкам при делении. Генная инженерия

Для реализации этой идеи требуется соответствующий репликон, который может легко выделяться, сохранять свои свойства н способен внедряться в клетку после введения в него чужеродной ДНК и, наконец, стабильно наследоваться. Репликоны, предназначенные для введения чужеродных ДНК в клетки, называются векторами

В распоряжении исследователя должны быть способы соединения исходных генов с вектором и введения рекомбинантиых репли-конов в клетку-хозяина. Необходимо также уметь отличать клетки, содержащие рекомбинантный репликон, от исходных реципиеитных клеток.

После введения нужного гена в реципиентную клетку задачи в зависимости от поставленной цели могут быть различными. Иногда оказывается достаточным просто внедрить чужеродный генетиче-

428 ский материал, в более сложном случае требуется осуществить его

- экспрессию в новом хозяине.

Нуклеиновые кислоты Методы решения всех этих задач целесообразно рассмотреть

на примере наиболее хорошо изученного реципиента — кишечной

палочки Е coli.

Способы соединения фрагментов ДНК, используемые в генной инженерии

Рис. 245. Расщепление молекул ДН К рестриктазои BamHl и соединение полученных фрагментов ДНК лигазой

Многие рестрикционные эндонуклеазы расщепляя ДНК, дают липкие концы' (см. с. 353) типа EcoRI, Hindlll BamHl, Sail, Pstl и др. При расщеплении одной и той же рестриктазои различных ДНК образуются одинаковые липкие концы и полученные фрагменты соединяются друге другом по этим концам ДНК-лигазой (рис. 245). Различные ДНК могут быть соединены при помощи ДНК-лигазы и по гульш концам.

Для обеспечения возможности расщепления рекомбинаитных ДНК по местам соединения вектора и вставки используются также

специальные приемы, наиболее распространенным из которых является метод линкеров (см. с. 377).

Нередко применяется коннекторная техника получения реком-бинантных ДНК. Она заключается в том, что с помощью концевой нуклеотидилтраисферазы (см. с. 351) к З'-концу одного фрагмента присоединяется гомополинуклеотид, например поли(оТ) или

429

Генная инженерия

Конце ая нукгеотидил трансферта

dATP

I ТТ(Т)ГТТ—ОН ¦ i НОАА(А)пААВ

i Соединение дяук фрагментов

ОН

|ТТ{Г)пТТ«-

¦ АА(А) ААЯ

ОН

Рекомбинантная

Рис. 246. Соединение двух фрш ментов ДНК KOHiiL-ктчрпым методам.

Таблица 15.

Эидоиуклеазы рестрикции, наиболее широко используемые в генной инженерии

Bam Н 1 С^САТС С С CTAGfC Ahalll TTT * AAA AAAt TTT

BgL II A J-catc T T ctag f a Alul AC^ct tc tCA

EcoR I G^AATT С С TTAAfG HacIII CG*CC CC fCG

Hind III aJ-acct t Т rCCAfA Hindi С 1 A GTT*CAC CAAfCTG gIt

Нра II C+CG G G CCfC Hindll CTPy^PuAC CAPu PyTC

Kpn 1 С GTAC^C СfCATC С Hpal CTTIaac CAAfTTC

Pst I С ТССА^С G f ACGT С Pall CC + CC CCfCG

Sal. 1 С *TCCА С С ACCTjG Pvull CACICTC GTC t GAC

Tag 1 TiCG A A GCfT Smal CCC^CCC CCCtCCC

430 поли(<1С), а к З'-концу другого фрагмента — полинуклеотид,

" комплементарный используемому в первом случае, т. е. поли (d А)

Нуклеиновые кислоты или Поли(с1С) (рис. 246). При добавлении фрагментов друг к другу

они комплексуются за счет образования комплементарных пар оснований между концевыми гомопол и нуклеотида ми а затем соединяются в клетке-хозяине с помощью ее ферментативного аппарата.

Векторы, используемые в Е. coli — плазмиды и бактериофаги

Молекула вектора должна отвечать определенным требованиям: быть небольшой, содержать уникальные участки расщепления рестрикционными эндонуклеазами, иметь маркеры для оптимальной селекции рекомбинантных клеток. В качестве-векторов для включения чужеродной ДНК в клетки Е. coli используются плазмиды (термин предложен Дж. Ледербергом) и бактериофаги. И те и другие являются репликонами.

Многие плазмиды, представляющие собой двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК, содержат гены, которые придают содержащим их бактериям некоторые феиотипические признаки, такие, как устойчивость к антибиотикам, солям тяжелых металлов и т. д.

Асе I2246'

PvuII2065

Рис. 247. Плаамида pBR322.

Если основная бактериальная ДНК имеет длину около 5-106 п. о., то 431

размеры плазмид составляют всего несколько тысяч пар оснований. -

Они легко выделяются и очищаются. Генная инженерия

Специально сконструированы векторные плазмиды, позволяющие отличать клетки, содержащие ре комби иантиые молекулы, от исходных бактериальных клеток. В качестве примера иа рисун-

ке 247 приведена плазмида pBR322, она содержит два гена, программирующие устойчивость к даум различным антибиотикам — тетрациклину (ген tet) и ампициллину (геи Ыа). В геие tet находятся уникальные участки расщепления рестриктазами Hindi II, BamHI и Sail, а в геие Ыа — участок расщепления Pstl. Если «разрезать» плазмиду любой из рестриктаз, участок расщепления которой находится в гене tet, и соединить ее методом липких концов с чужеродным фрагментом ДНК, то в полученной ре комби нантной молекуле останется нетронутым только ген Ыа, а ген tet утрачивает свою активность, поскольку его последовательность разрывается

432

Нуклеиновые кислоты

вставкой. Наоборот, при разрезании плазмиды рестриктазои PstI и внедрении в этот участок фрагмента ДНК инактивируется ген Ыа, тогда как ген tet продолжает обеспечивать синтез белка, придающего Е. coli устойчивость к тетрациклину. Использование такой методологии позволяет быстро идентифицировать клетки, содержащие рекомбинантные плазмиды. Применение подобного приема показано на рисунке 248. Расщепление исходной плазмиды pBR322 по сайту BamHl и последующее лигирование с фрагментом ДНК приводит к смеси исходных и рекомбинантиых плазмид. При введении этой смеси в Е. coli образуются клетки трех типов — не содержащие плазмиду, содержащие исходную pBR322 и клетки с рекомбииант ной плазмидой. Их легко отличить по различной устойчивости к антибиотикам.

Анализируемую ДНК можно вводить и в другие реп ли коны, способные размножаться в клетках Е. coli, например в бактериофаги. Из множества известных фагов чаще всего в качестве вектороа используют сконструированные производные фага к и фагов MI3 и fd.

Большое разнообразие векторов существует на основе бактериофага К, в них используется особенность фага, состоящая в том, что значительная часть его ДНК не нужна для размножения фага в клетке (рис. 249). Это позволяет вводить чужеродную ДНК в ДНК фага >. при использовании его в качестве вектора, причем длина вставляемого фрагмента может быть существенно больше величины фрагмента, встраиваемого в плазмиду.

Важную группу векторов, широко используемых при установлении первичной структуры ДНК, составляют нитевидные бактерио фаги, такие, как М13, fd и fl. Фаг М13 представляет собой одно-цепочечную циклическую ДНК длиной около 6500 нуклеотидов. После инфицирования бактериальной клетки одноиепочечиая ДНК фага превращается в двухцепочечную репликативную форму (RF), которая во всех отношениях подобна плазмиде. Кроме того, фа говая ДНК содержит короткий участок (500 нуклеотидов), назван ный межгеииой последовательностью (МП), несущественный для ее жизнеспособности (рис. 250).

Таким образом, выделив репликативную форму ДНК и расщепив ее в области несущественного участка, можно с помощью лигазы вставить в место разрыва чужеродную ДНК. Введение рекомби-иантной двух цепочечной молекулы в клетку Е. coli приводит к ее

Рис. 24ч. Упрошенная генетическая карта фага л (зачерченный участок соответствуют генам, несущественным для размножения фага).

Гены, кодирующие белни оболочки

Гены, важные для реплинации

IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIH

Гены, ответственные за разрушение клетни фагом

433

репликации, синтезу ( + )-цепи, упаковке последней в белковый чехол и выделению фага в среду. Далее инфицированная нитевидным фагом клетка, продолжая делиться, хотя и с замедленной скоростью, постепенно выделяет в окружающую среду большое количество фага. Этот фаг содержит в вирноне одноцепочечную циклическую ДНК, в которую встроена одна из цепей чужерод ной ДНК.

Трансформация, трансфекция, клонирование и селекция

Процесс введения плазмиды в клетку, вызывающий наследственные изменения в ней, называется трансформацией. Процесс инфекции клеток с помощью чужеродных ДНК, приводящий к образованию зрелого фагового потомства, называется трансфекцией. Практически наиболее общий способ трансформации и трансфекции основан на том, что при обработке клеток бактерий CaCI их мембрана становится проницаемой для ДНК. Эффективность проникновения экзогенной ДНК в клетку низка. Для плазмид типа pBR322 можно получить 10й— 10' транс формантов при добавлении 1 мкг плазмиды к обработанным CaCI клеткам, т. е. из каждых 10 — 10 плазмид в клетки попадает только одна. Поэтому среди бактерий, подвергшихся трансформации, только небольшая часть оказывается

434

Нуклеиновые кислоты

Рис. 251. Е. coli.

Чашка Петри с колониями

трансформированной. Отделение ее от общей массы выполняется в процессе клонирования (см. с. 372). Операция заключается в посеве бактериальной суспензии определенной концентрации на твердую питательную среду, например на агар с питательными добавками в чашке Петри таким образом, чтобы на I см поверхности приходилось 5—10 бактерий. Бактериальная клетка, попавшая на поверхность агара, начинает делиться, и в конечном счете в точке локализации образуется семейство ее потомков в виде маленькой колонии, по внешнему аиду похожей на шляпку гриба. Эта колония называется клоном (рис. 251). Каждая клетка исходной суспензии образует свой клон, все клетки которого имеют свойства бактерии-родоначальника (позитивная колония).

Если в качестве вектора служит плазмида pBR322, то для отбора бактерии-трансформантоа ^используют добавление в питательный агар антибиотика — ампициллина или тетрациклина, в зависимости от того, какой из генов, Ыа или tet остался интактиым после аведения чужеродной ДНК. На такой среде клоны образуют только клетки с плазмидами. Для отделения рекомбинантных бактерий часть материала каждого клона переносится на другую чашку Петри, содержащую антибиотик, ген устойчивости к которому был разрушен при создании рекомбинантоа. На этой чашке Петри дают клоны только те бактерии, которые содержат исходную плазмиду pBR322 а рекомбинантные бактерии клоны не образуют. После такой идентификации рекомбинантные клоны могут применяться для дальнейшего анализа. Отбор по определенному биологическому признаку, в частности по устойчивости к антибиотику, называется селекцией.

Олиго (dT)

Поли (А)

Обратная транскриптаза ^сШР

ДНК-гибрид РНИ

с—г

страница 57
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(29.06.2017)