Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

дние годы в связи с интенсивным развитием физико-химической биологии, геи ной инженерии и биотехнологии все возрастающее практическое значение приобретает хи ми ко-ферментативный синтез фрагментов нуклеиновых кислот, в том числе искусственных генов биологически активных пептидов и белков.

В частности, в СССР получены бактериальные штаммы, способные продуцировать проинсулин человека — биосиитетнческий предшественник инсулина. Проинсулии состоит из одной полипептидной цепи длиной 86 аминокислотных остатков и может быть превращен

382

Нуклеиновые кислоты

в инсулин путем направленного протеолиза. В основу бактериальных штаммов — продуцентов проинсулина человека положены рекомбинантиые плазмиды, несущие синтетический ген проинсулина. Эта последовательность фрагмента ДНК, длиной около 300 нуклеотидных пар, получена хи ми ко -ферментативным синтезом (рис. 217, 218). С использованием синтетического гена были получены бактериальные штаммы — продуценты проинсулина человека в составе химерных белков, в частности гибрида с галактозидазой E.coli (рис. 219) и гибрида с а амилазой B.subtilis. Во всех случаях достигнут высокий уровень экспрессии проинсулина, который превращался в инсулин путем ферментативного гидролиза.

В 1982 г. группами М. Н. Колосова и Л. С. Саидахчиева был завершен полный химико-ферментативный синтез структурного лейкоцитарного интерферона человека а Искусственный геи интерферона (рис. 220) кодирует полипептид длиной 165 аминокислотных остатков. В процессе синтеза кодирующие триплеты были

Колосов Михаил Николаевич (1927—

1965), советский химик-органик, академик АН СССР (1974). Окончил Московский институт гонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова (1946), с 1959 г. работал в Институте биоорганической химии им. М. М. Шемякина АН СССР. Основные работы — в области химии нуклеиновых кислот, антибиотиков и других природных соединений. Синтезировал тетрациклин и изучил механизм его действия Осу ществил синтезы структурных генов валиновой тРНК, «-интерферона человека и др. Лауреат Ленинской премии [1965)

Рис. 219. Экспрессия гена проинсулина чеювека в составе (ибридного белка с галак зидазой.

Ген проинсулина

Проинсулин

Инсулин

Фрагмент I

т ю Mel -Cys -Asp -Leu -Pro -Gin -Thr -His -Ser -Leu -Gly -Ser

¦Arg -Arg -Thr —leu -Mel -Leu _

ATG TGT GAT CTG CCG CAC ACT CAC TCT CTC GGT TCT CGT CGT ACT CTG ATG CTG "?*s. \ TAC АСА СТА GAC GGC I OA GTG AGA GAC CCA AGA GCA GCA TGA GAC TffC GAC Ca °\ -j.

Фрагмент 11

ACC GAA GTC ATG ACG GTC TTT CAG GCA AGA GAA AAG AGA GAT ACG ACG tjifcy TGC CTT CAG TAC TGC CAG AAA GTC CGT TCT CTT TTC TCT СТА TGC TGC ^S. /

^ СД^- l" i I DO 90 'l ^>

fgiff phe'У _phe—AlP -H,S —Ar9 ~AsP —Ly* —Leu -Cys —Ser —Phe -Leu —Ser —lie —Arg - Arg ' "ft'Pro • f I Glnao 50

GluG| phe-Gly-Asn-GIn -Phe -Gin -Lys-Ala -Glu -Thr - lie -Pro—Val -Leu -His

-. gag ttc ggt aac cag ttc cag aaa U ctc aag cca ttg gtc aag gtc ttt

GfcT

Фа

act атс cct gtt ctg cat ctt tga tag gga caa gac gta

GAA

Фрагмент III

GTC CCA AGC AGl AGA AGA .TC TTT AG АГ,А GAA CAG GTT GAA GAT TTG ,

KG. JCT T.CJ CAG AAA TCA Tv-T CTT GTC CAA CTT GTA AAC

„,Asp-Trp —Ala -Ala— Ser —Ser —Asp -Lys -Thr-Ser-Phe—Le'u—Asn-Phe—lie-Gin — Glu r 70

CP

Asp - Lys - Phe - Tyr - Thr - Glu — Leu - Tyr — Gin— Gin - Leu- Asn - Asp - Leu - Glu - Ala - —

_2*;_JTO_?4J_r_Ti___¦¦,!>_ Lj

JFrC GAC AJAA TTC TAC ACT GAA CTG TAC CAG CAA. CTC AAC GAC CTC. GAG GCI

CTG TJTT AAG ATG TGA CTT GAC ATG GTC GTT GAG TTG CAG GAG CTC CGA л*Т

EcoRTI

Фрагмент IV

S~& CAG GAT GCT АТС CTC TTT CAT CAG CGG AGT TTC GGT AAC ACC AAC GCC \^

*-"ьТТПТА CGA TAG GAG AAA GTA GTC GCC TCA AAG CCA TTG TGG TTG CGG 3^

*- kZ-'-! J .JO 2-a fjV4

/^JV'A)aLeu - He -Ser - Asp -Glu -Lys -Met - Leu - Pro - Thr -Glu -Thr - Val -Gly - Val - Gly -

N( Val

I Argizo 13D Vc^iV *-Vs Tyr - Phe - Gin - Arg - lie - Thr - Leu - Tyr - Leu - Lys - Glu - Lys - Lys - Tyr - Ser - Pro — „ 570__это_ .n_ 11'___Cj-j

r?e TAT TTC CA? CGT Afr ACT CTJ. TA? CTG AACj rAA AAG AAG. TAI АГ.Г Гг"гр~> lr ATA ,'AG GT:. GCA TAb TGA GAA ATG GAC TTl uTT TTC TTC ATA Tib lut /6/

Фрагмент V

Фрагмент VI

Sau 3AI

CAG GTT AGT AGA CAG GGA GAA GGA ACG GATLfiJLI—CTC AGC ACS ААГ AAr ^ GTC CAA TCA TCT GTC CCT CTT ССТ TGC СТА СТА SAG TCS TKT. TTG ТТГ,

470 flicj <«o A30 Crv

,J_eu- Asn - Thr - Ser— Leu - Ser —Phe - Ser - Arg - Met - lie - Glu - Ala - Arg - Val - Val ~~

Stop

GCA AuA TTC CTT АТС

Рис. 220 Нуклеотидная последовательность синтетического гена интерферона и кодируемая ею последовательность аминокислот

384 выбраны в соответствии с частотой встречаемости в E-coli для

— достижения высокого уровня экспрессии гена. Далее структурный

Нуклеиновые кислоты ген интерферона человека а2 был присоединен к синтетическим

участкам ДНК, контролирующим экспрессию генов в E.coli (среднестатистический бактериальный промотор, оператор iac оперона Е coli и участок связывания рибосомы). Все это вместе составляет фрагмент ДНК величиной свыше 600 п.о., что является к настоящему времени одной из самых длинных синтетических последовательностей ДНК.

Химическая модификация нуклеиновых кислот

Нуклеиновые кислоты — полифункциональные соединения, содержащие большое число реакционноспособных групп. При действии различных химических реагентов в них могут модифицироваться все компоненты: гетероциклические основания, углеводные остатки и остатки фосфорной кислоты.

Реакционная способность мономерных структур в составе полимера в значительной степени изменяется под влиянием пространственных факторов. Наибольшее значение имеют методы селективной модификации, широко применяемые при исследовании первичной и пространственной структуры нуклеиновых кислот, введении искусственных мутаций и изучении связи между строением и биологической функцией.

Модификация гетероциклических оснований

Гетероциклические основания определяют специфические свойства нуклеиновых кислот. Их реакционноспособность по отношению к различным агентам зависит от природы основания, условий проведения реакции, а для олиго- и полинуклеотидов — вторичной структуры соответствующего соединения.

Реакции пиримидиновых оснований с бисульфитом натрия. Бисульфит-нон способен обратимо присоединяться к С(5) — С(6)-двонным связям цитозина, урацила и тимнна в мягких условиях, образуя соответствующий аддукт, неустойчивый в случае тимнна; практическое значение имеют только реакции с урацилом и цито-зином. Продукты присоединения к урацилу и цитозину довольно стабильны в нейтральной и кислой средах, но отщепляют бисульфит-ион в щелочной среде.

Важным свойством 5,6-дигидропроиэводных цитозииа указан- 385

но го типа является повышенная pea кциоииоспос обнос ть амино- -

группы, которая легко замещается под действием различных нуклео- Химическая модификация

фильных агентов. Замещение аминогруппы на ги дроке и группу нуклеиновых кислот

приводит к производному урацила, которое легко превращается в урацил при слабоосновных значениях рН. Таким образом, эта реакция дает возможность специфического преобразования цитози-новых колец в урацильные.

Цитоэин

R—рибоза или деэоксирибоза

Реакция бисульфита с одноцепочечнымн нуклеиновыми кислотами протекает значительно медленнее, чем с мономерами, и практически не идет с двухцепочечиыми молекулами.

Модификация нуклеиновых кислот бисульфитом часто используется как способ введения мутационных замен. С этой целью участок ДНК, выбранный для введения мутаций, превращают в одноцепочечиый и затем обрабатывают бисульфитом в условиях неполного дезаминирования. Таким образом, например, пары G С могут быть заменены на пары AT (такие замены называются транзициями).

Специфичность к вторичной структуре используется также для анализа пространственного строения полинуклеотидов. Так, обработка тРНК бисульфитом приводит к модификации только цитози новых оснований, находящихся в петлях.

Реакции с гидразином и гидроксиламином. Гидразин, его алкиль-ные и ацильные производные, а также гидроксиламии и его О ал-кильные производные широко применяются в исследованиях нуклеиновых кислот. В водных растворах при кислых значениях рН эти реагенты специфически взаимодействуют с производными цитозииа.

X = H. Alk, Ac

R рибоза или дезоксирибоза R1=H, Alk

В случае гидразина и его производных наблюдается лишь замещение аминогруппы, тогда как производные гидроксиламина одновременно присоединяются по двойной связи, образуя аддукт.

В щелочных условиях реакции с гидразином и гидрокснлами-иом приводят к расщеплению гетероциклических колец пиримиди-нов (см. с. 325), практически не затрагивая пуриновых оснований. Реакция ДНК с гидразином, сопровождающаяся расщеплением по пиримидиновым звеньям, используется при определении нуклеотиднои последовательности ДНК в методе Максама — Гилберта.

При анализе первичной структуры нуклеиновых кислот для специфического расщепления по урацильным или цитозиновым звеньям может быть использована также и реакция с гидроксил-амином в щелочной среде.

Окисление. Реакция с Os04, широко применяемая в органической химии для гидроксилирования двойных связей, гладко протекает и в случае пиримидиновых оснований. Скорость реакции возрастает в ряду Т > U > С, так, тимидин реагирует почти на два порядка быстрее цитидина и в 10 раз быстрее уридииа. Поэтому ее можно рассматривать как специфический метод модификации тимидина

При взаимодействии тимидина с OsO образуется циклический эфир осмиевой кислоты, который легко гидролизуется до диола, а

г

последний под действием щелочи превращается в замещенную мочевину. Если модификации подвергаются денатурированные полидезокс и нуклеотиды, то обработка после реакции щелочью создает возможность их специфического расщепления по тимидино-вым звеньям.

Диольные соединения образуются при взаимодействии пиримидиновых оснований и с такими окислителями, как КМп04, Н2Ог. Однако в этом случае быстро происходит разрушение цикла.

Реакция с Os04 может использоваться для установления положения тимидиновых звеньев при определении первичной структуры ДНК методом Максама — Гилберта.

Галогенирование. Одним из распространенных методов модификации оснований в нуклеиновых кислотах является галогеиирова-ние. Реакция протекает различно в водных и безводных средах.

Наиболее активные галогенирующие агенты — хлор и бром. При бромированни (или хлорировании) производных нуклеиновых кислот в водных нещелочных средах происходит присоединение галогена по С(5)—С(6) двойной связи колец пиримидина и разрушение гуанина. Аденозин в этих условиях с галогенами ие реагирует.

С практической точки зрения важна реакция иодирования нуклеиновых кислот в водных растворах. При действии I или I -ионов в присутствии трех хлористого таллия CTICI ) иа одноцепочечные ДНК преимущественно иодируется цитозин, образуя 5-иодопроиз-водные. При реакции с РНК наряду с 5-иодцитозином образуется 5-иодо-6-гидрокси-5,6-дигидроурацил. При использовании радиоактивного удается получить меченые поли нуклеотиды с высокой удельной активностью, которые применяются в опытах по гибридизации.

В безводных растворителях под действием Clj, Вг^ или соответствующих N-галогенимидов происходит электрофильное замещение водорода у атомов С(5) пиримидиновых оснований и С(8) гуанина с образованием соответствующих галогенпроизводных. Эти соединения используются в качестве субстратов РНК- и ДНК-полимераз для синтеза специфически меченных полинуклеотидов.

Меркурирование. Широко распространенная в органической химии реакция непредельных соединений с ацетатом ртути в случае нуклеиновых кислот проходит в мягких условиях (вода, рН 6,0—7,0,

387

Химическая модификация нуклеиновых кислот

BrjCHjO)

1 1?

R рибоза или деэонсирибоза

40—50 °С) и специфична по отношению к пиримидиновым основаниям. Результатом реакции является образование производных 5-ацетоксимеркуриоурацила и 5-ацетоксимеркуриоцитозина.

388 5-Меркуриопроизводные вследствие легкого обмена атома ртути

--на атомы галогена или трития используются для получения специ-

Нуклеиновые кислоты фически меченных пиримидиновых основании нуклеиновых кислот.

Алкилирование. Реакции алкилироваиия имеют большое значение для изучения нуклеиновых кислот. С одной стороны, многие алкилируюшие реагенты являются мутагенами и канцерогенами, а с другой стороны, реакции алкилировання, осуществляемые в мягких условиях, широко используются для исследования структуры и функции полинуклеотидов.

Наиболее хорошо изучено взаимодействие нуклеиновых кислот и их компонентов с диметилсульфатом (CH3)2SOfl. Эта реакция протекает в мягких условиях в водных растворах.

Направление реакции алкилировання определяется природой гетероциклического основания и условиями эксперимента. Гуани новое кольцо в нейтральной среде алкнлируется преимущественно по атому N(7), а в щелочной — по атому N(1). Исчерпывающее метилирование приводит к 1,7-диметилгуанину.

В аденине и его производных все три атома азота могут подвергаться метилированию, однако скорость реакции убывает в ряду N(1)>N(7) > N(3). Единственным продуктом метилирования цитозина является 3-метилцитозин.

О

В ДНК метилированию подвергаются атомы N(3) аденина выходящие в малую бороздку В формы ДНК, и в большей степени атомы N(7) гуанина, выходящие в большую бороздку. Основания двухцепочечных ДНК, метилированные по атомам N(3) и N(7), продолжают образовывать комплементарные пары, но эффективность их взаимодействия понижается.

7-Метилгуанин и 3-метиладении легко отщепляются от полидезоксирибонуклеотидной цепи в результате разрыва N гликозид ных связей. Далее полииуклеотидиая цепь может быть легко расщеплена по модифицированному звену действием щелочи или аминов (см. с. 322). Такой метод деградации используется для определения последовательности ДНК (локализация гуани новых и адениновых звеньев по методу Максама — Гилберта).

Реакции с карбодиимидом. Для исследования туры нуклеиновых кислот применяется реакция изводными карбодиимида в результате которой ветствующие аддукты.

вторичной струк- 389

оснований с про- -1-

образуются соот- Химическая модификация

нуклеиновых кислот

R - полннунлеотидная цепь

R1 N= С— N R1 — водорастворимый карбодиимид

С наибольшей скоростью модифицируются редкие компоненты нуклеиновых кислот — инозин и псевдоуридин. Реакция с карбодиимидом практически не идет с двухцепочечными полинуклеоти-дами В нуклеиновых кислотах, содержащих как двухцепочечные, так и одноцепочечные участки, модифицируются только последние, что используется при исследованиях вторичной структуры тРНК.

Ацилирование. В реакцию ацилирования под действием ангидридов и галогенангидридов органических кислот вступают как амино- и иминогруппы так и ги дроке ильные группы углеводных и фосфатных остатков.

Например, при действии на цитидин бензоилхлорида в безводном пиридине пр

страница 51
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(19.10.2017)