Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

эндо-нуклеаз рестрикции EcoRI и BamHl Таким образом, этот фрагмент может быть вставлен в векторную плазмиду pBR322, расщепленную нуклеазвми EcoRI и BamHl, н клонирован в Е. coli.

Leu

Met 1 т у r Gly Gly Leu1 Stop

5JAATTC. ATG TAT GGT GGC CTG TAA [g"~

Рис. 20V. Кодирующая последователь- i q\ TAC ДТА CCA CCG GAC ATT 'CCTAg!

ность лей цин-эн кефали на с инициирую- >¦--------> l--------.

щим и терминирующим кодонами. EcoRI В Н

При необходимости рекомбинантную плазмиду выделяют из 373

клетки, а требуемый фрагмент вырезают из нее действием двух -

рестриктаз, как показано на рисунке 210. Если синтезируется Синтез нуклеиновых кислот

очень длинная последовательность, то синтез планируют таким образом, чтобы можно было клонировать составные части последовательности (модули) по отдельности.

Рнс. 210. Клонирование и «вырезание» синтетического фрагмента из вектора PBR322.

Как показано выше, для успешного клонирования модулей синтетического гена на определенных участках его последовательности должны содержаться подходящие сайты (меств), узнаввемые эндонуклеазами рестрикции. Эти сайты должны быть уникальны как для самого гена, так и для вектора, в котором он клонируется. Рестрнктные сайты необходимы для введения каждого модуля в плазмиду или фаговую ДНК, его регенерации из векторной молекулы после клонирования н соединения с другими частями целевого гена. Обычно для этого используются сайты, имеющиеся в последовательности синтезируемого гена. Так, последовательность, которую планируется синтезировать (рис. 211), содержит учвсток расщепления Bam HI во внутренней области и участки расщепления рестрнктазамн EcoRI и Sail на концах. Части 1 н И этой последовательности синтезируются отдельно и клонируются в плазмиде pBR322. После «размножения» клонированных фрагментов в составе рекомбинантных плазмнд онн могут быть выделены и соединены по липким концам с образованием нужной последовательности.

Однако чаще всего необходимых внутренних сайтов в гене либо не имеется, либо их мало (не более 1—2 на несколько сотен пар оснований (п.о.) ]. Это сильно ограничивает возможности хнмико-ферментативного синтеза двухцепочечных ДНК и создает необходимость в разработке н использовании для получения полинуклеотидов специальных приемов.

Было предложено несколько таких подходов С. Нарангом (Канада), P. By (США) и В. А. Ефимовым (СССР).

В качестве примера рассмотрим один из них. В его основу были положены модульный принцип конструирования ДНК и использование временных сайтов уникальных эндонуклеаз рестрикции для последовательного клонирования отдельных фрагментов и сборки целевого полинуклеотида. Дополнительные рестриктные сайты вводятся в последовательность гена в произвольно выбранные места.

374 содержащие какой-либо самокомплементарный динуклеотид AT,

- ТА, CG или GC. Для этого последовательность гена как бы раз-

Нуклеиновые кислоты двигается и между ними вводится тетра- илн пентануклеотид, рбра-

зуя соответствующие рестрнктные сайты.

Последовательность гипотетического гена

agct tcga

caatgg. TTGCAG ..gttacc..........ААвЯтС.

_* L_

- Вводимые тетрануклеотиды

Последовательность гена с временными сайтами

caaagct tgg ...т 1ш*<с..

. gt ttcgAacc ... ааИвИИтс .

Hmdm EcoRI

Для удаления созданного дополнительного рестриктного сайта синтезированная ДНК расщепляется соответствующей рестрикта-зон, образующиеся выступающие одноцепочечные последовательности удаляются действием S нуклеазы Asp. огугае и «тупые» концы молекулы соединяются с помощью Т4 ДНК-лигазы. Разбивка последовательности ДНК на модули проводится произвольно.

Синтетическая ДНК

.CAACGCTTGGTTGsAAT TCAG........

.GT TGCGAACCAAC f t AAJDTG........

EcoR I-сайт

, , Расщвпление EcoR X

.CAACGC T TGGT TO AAT TCAG.

.GT TGCGAACC A ACT T AA OTC.

j Si —нуклеаза

CAACGC T TGGT TO CAT......

.GT T GCGAACCAA< OTA......

j T4 ДНК—лигам

..CAACGC T TGGT TGC AT.........Цвлеюй

..GT TGCGAACCAACGTA.........полииуклеотид

\

Место стыка

Планируемая последовательность

5 ААТТС"

G.

EcoR I

Bam HI

GGATCC CCTAGG

. CAGCT 5' Sal]

Синтетические Фрагменты

5 ААТТС G.

EcoR [

G

. CCTAG 5' BamHI

GATCC" G_

Bam HI

"G

.CAGCT 5' Sail

EcoRI

Клонирование в • pBR322, расщепленную EcoRI и BamHI

В mHI

Рекомбинантная плазмида с фрагментом I

Клонирование в pBR322, расщепленную BamHI и Sail

II

BamHI

Рекомбинантная плазмида с фрагментом [I

Трансформация в E.coli, амплификация выде ение рекомбинантных плазмид и их расщепление EcoRln ВатН1для 1и BamHI и Sail для II

Рис. 211. Создание синтетических генов с промежуточным клонированием.

376

Нуклеиновые кислоты

Рис. 212. Способ сборки искусственного гена с использованием временных ре рнктных «сайтов», состоящий в последовательном клонировании модулей синтезируемой ДНК.

Отдельные модули-фрагменты целевой ДНК могут быть получены любым из обсуждавшихся методов: лигированием синтезированных химически олигодезокснрибонуклеотидов, сепаративной достройкой З'-концов дуплекса, образованного двумя частично комплементарными олигомерами, или комбинацией этих методов. Перед соединением в одной плазмиде индивидуальные дуплексы-модули предварительно очищают клонированием. Схема сборки синтетического гена из готовых субфрагментов с использованием временных рестриктных сайтов приведена на рисунке 212.

Последовательность гена

Использование синтетических олиго- и полинуклеотидов в биоорганической химии и биотехнологии

377

Синтез нуклеиновых кислот

Диапазон применения синтетических олиго- н полинуклеотидов необычайно широк. Прежде всего при изучении белков нередко осуществляется синтез соответствующих генов и их фрагментов (если число аминокислотных остатков не превышает 200—250). Путем экспрессии генов с помощью генноннженерных приемов получают значительные количества труднодоступных белков и пептидов, а также нх аналогов.

Однако наиболее широкое применение находят сравнительно короткие олигонуклеотнды. Для того чтобы придать фрагменту нуклеиновой кислоты необходимые для встраивания в определенный участок векторной молекулы липкие концы, синтезируются так называемые линкеры, т. е. двухцепочечные олигонуклеотнды, содержащие последовательность, расщепляемую той или иной рестрик-ционной эндонуклеазой. Обычно в качестве линкеров применяются самокомплементарные олигонуклеотнды длиной 8—10 нуклеотидных звеньев. На рисунке 213 демонстрируются некоторые типы линкеров.

Рнс. 213. Типы пинкеров, используемые в генноннженерных исследованиях.

г—J-----------п

EcoRI 2[S'd(pG-G-A-A-T-T-C-C)]iT 5'pGl-G-А-А-Т-Т-Сь С У С««.с.ом-

плсмен-

Одьоцепочечна* форма 3'С|— С —Т — Т— A— A— G|—Gp 5 «рный

i------------ линкер

Двухцепочечная форма

l~5'd(pA - А—Т—Т — C-W — С — G — А -КЗ) 3' j Адаптор-

(G+A-G-C-T -1-С —С—Т —A —Gp) 5' | линкер EcoR I BamH I

5d(pA-A-T-T-C-C-C-G-G-G) 3r (G-G-G-C-C - Cp)d5'

Дополняющие линкер

Прн работе с рекомбинантнымн молекуламн ДНК возникает необходимость замены одного типа липких концов на другой. Для этой цели используются адапторные линкеры — частично двухцепочечные нуклеотиды, содержащие липкие концы, соответствующие двум разным рестриктазам. Третий тип линкеров позволяет перейти от тупого конца ДНК к липкому, и их можно назвать дополняющими.

378

Нуклеиновые кислоты

Фершт (Fersht) Алан Рой (р. (943), английский кимик-биоорганик. Окончил Кембриджский университет (1968), с 1978 г.— профессор Лондонского университета. Один из основоположников белковой инженерии.

С помощью синтетических фрагментов ДНК можно модифицировать природные гены вводя в них определенные изменения. Так, синтетические олигонуклеотиды были использованы для превращения гена интерферона человека в форму, пригодную для прямой экспрессии в клетках Е coli (рис. 214). Интерферон синтезируется в виде предшественника, и его превращение в истинный белок происходит в результате отщепления сигнального пептида. Клетки E.coli не могут осуществлять данный процесс, и поэтому от гена интерферона человека была in vilro с помощью рестрикцией ной эндонуклеазы Sau3AI отщеплена часть, кодирующая сигнальный пептид. Однако фермент вместе с частью, кодирующей сигнальный пептид, отщепляет н кодон первой аминокислоты зрелого белка. Для восстановления полного гена к его остатку присоединяли синтетический фрагмент, содержащий кодон первой аминокислоты, инициирующий кодон, а также липкий конец EcoRI для введения промотора. Таким образом был восстановлен целый ген, пригодный для прямой экспрессии интерферона в клетках E.coli.

Очень важным является использование синтетических олигонуклеотидов в качестве гибридизационных проб (зондов) для поиска нужных рекомбинантных колоний в генноинженерных экспериментах. Олнгонуклеотид синтезируется в соответствии с данными, полученными из известной структуры белка илн ДНК, и после введения концевой метки 32Р используется для гибридизации in situ с рекомбннантной ДНК бактериальных клонов, выращенных на нитроцеллюлозных фильтрах и иммобилизованных на ннх. Для того чтобы поиск нужного гена был эффективным, олнгонуклеотид должен иметь последовательность, комплементарную фрагменту искомого гена. Естественно, чем больше длина нуклеотида. тем меньше вероятность встретить соответствующую ему последовательность одновременно в нескольких участках генома. Необхо-

Сигивльный пептид

—L eu Gly —CTG GGC —GAC CCG

Зрелый интерферон

Cys!

tgt!

l

АСА

Asp GAT СТА

EcoRI *

A A II

IMet ATG TAC

Cys TGT

L eu— С TG— Q>C-

SaL ZAl

I

Asp Le li GAT CTG -

Синтетический фрагмент

Остаток гена интерферона без первого ко доне

т IMet Cys {Asp Leu AAT ТС ATG TGT ! GAT С TG-

Рис. 214. Превращение гена интерферона человека в форму, пригодную для экспрессии в Е. coli.

G TAC АСА СТА G*AC-Sdu3Al

димая длина олигонуклеотида, в свою очередь, зависит от сложности 379

генома: чем он сложнее, тем она должна быть больше для обеспе- -

чения уникального узнавания. Синтез нуклеиновых кислот

Расчеты показывают, что для специфичного связывания с геном в геноме, например для бактериофага достаточна длина 12 нуклеотидных звеньев, последовательность 15 звеньев идентифицирует уникальный ген в дрожжевом геноме, а 18—20-членные олигонуклеотнды используют для поиска генов в банке генов млекопнтаю щих.

Т

5'- TCGA ТТСО-3'

3'- AGCTTTTGCTTAAGG — ДНК гена

Рис. 215. Структура синтетических олигонуклеотидов, предназначенных для замены одною нуклеотида на другой («). введение встапки (б) и деч^ции в ген, клонированный в однонитевом фаге.

(6)

(в)

С-О Т' ЧА 5" — TCGAATTCG—3' 3'- AGCT TAAGC - ДНК гена

5'— TCG ACGA AGGCC -3' З'-AGC TGCT Т CCGG -ДНК гена

О

А

Особое место занимает область применения синтетических олигонуклеотидов для введения направленных изменений в структуру гена н затем—в структуру соответствующего белка, называемая белковой инженерией. Чаще всего для этой цели гены клонируют в ДНК нитчатых фагов, хотя возможно применение и других векторов, например плазмид. Для того чтобы ввести мутацию в определенный участок гена с известной структурой, клонированного в фаге (М13 или fd), синтезируется олигонуклеотид, частично комплементарный последовательности, которая содержится в ( + )-цепн ДНК однонитевого фага. Отступления от комплементарности в синтезированном олигонуклеотнде определяются задаваемой мутацией. Это может быть простая замена комплементарного нуклеотида на другой, не комплементарный, деления илн вставка нескольких нуклеотидов, как показано на рисунке 216. Частично комплементарный синтетический олигонуклеотид гибридизуется с однон из цепей ге иа в одноцепочечной фаговой ДНК (рнс. 217), и затем с помощью ДНК-полимеразы (не содержащей 5'-*3'-экзонуклеазной активности) в присутствии четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов синтезируется вторая цепь, причем синтетический олигонуклеотид играет роль затравки.

Вновь образованная двухцепочечная ДНК ковалентно замыкается с помощью ДНК-лигазы. Эта ДНК представляет собой гетеродуп-лекс, в котором комплементарность нарушена в месте введения мутации. Одна цепь гетеродуплекса представляет собой дикнй тнп, а другая — мутантный. Ковалентно замкнутым гетеродуплексом трансформируются клетки Е. coli. В результате репликации эти

/ \

й ¦ С ®

Рис. 21 и. Принцип олигонуклеотид-!-правленного мутагенеза.

380 клетки содержат как мутантные, так и дикие фаги. Смесь фагов

- выделяется и высевается на чашки Петри таким образом, чтобы

Нуклеиновые кислоты каждый фаг дал отдельную колонию. Для отличия диких колоний от

мутантных используются разнообразные методы — биологические, если мутация меняет биологическую функцию, рестриктный анализ при нарушении участков расщепления рестрик азами илн гибридизация с оли го нуклеотида ми, использовавшимися для введения мутаций. Последний метод основан на том, что неполностью комплементарные олигонуклеотиды образуют с ДНК значительно менее стабильные комплексы, чем комплементарные олигонуклеотиды и гибридизующиеся при более высоких температурах. Поэтому гибридизация с ДНК фагов, фиксированных на нитроцеллюлоэных фильтрах, при низких температурах приводит к образованию комплексов как с мутан ными, так и с дикими ДНК, а при высоких — только с мутантными, которым синтетический олигонуклеотид полностью комплементарен.

Направленный мутагенез и синтез генов сделали реальным Рис. 217.Синтетический ген проинсулина создание белков обладающих измененной биологической актив-человека, ностью, например получение ферментов с улучшенными свойства

5'

Eco R I fN_

5* AAT-TCATG TTT GTC AAT CAG САС

Met Phe Val Asr _A_

Leu Cys Gly Ser His LeuA

CTT TGT GGT TCT CAC CTG

^GTAC AAA CAG TTJ GTC GTG GAA АСА CCA^AGA CTG GAf> %

С

I

\Val

GTA GAA GAA ACC ACG TTC CCC АСА CAC CAG GTA CAG

-CAT CTT CTT TGG TGC AAG GGG TGT GTG GTC CAT GTC &ffyrPhe Phe Gly ArY G1" Gly Cys Val Leu^Tyr Leu

Gin Val Gly Gin /4_

cVyi Ihr Arg Arg Glu Ala Glu Asp L

c*y^Leu Pro GUI Leu Ser G*ly Ala Gly Pro "lily Gly Gly TILeu

G\?1uGly Ser Leu Gin Lys Arg Gly lie Val Glu Gin GGT TCC CTG CAG AAG CGT

CCA AGG GAC GTC TTC GCA

Cys

тта ctA gtt UCA 6TA STT CTC CAS^TTg GTA

at gat caa cgt cat caa gag gtc

H1nd III'Ter Ter Asn Cys Tyr A"sn Glu Leu uTri TyrLeu" Ser Cys lie

ми. Если известна структура активного центра фермента и его 381 комплекса с субстратом, то с помощью направленного мутагенеза и -

генноннженерных приемов можно заменить определенные амино- Синтез нуклеиновых кислот

кислоты активного центра на другие, изменив тем самым каталитические свойства фермента. Так, А. Фёршт, Г. Внитер и сотр. (Великобритания) путем замены треоиииа на аланин в активном центре тирозил-тРНК-синтетазы улучшили константу связывания фермента с АТР в 100 раз.

Такие пути улучшения старых и создания новых белков открывают большие возможности для медицины и биотехнологии.

В после

страница 50
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(11.12.2017)