Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

в является N-метили ми дазол (Melm), в присутствии которого реакция меж-нуклеотидной конденсации протекает за несколько минут. Использование Melm дало возможность проведения реакций не только в пиридине, но и в других органических растворителях (диоксан, ацетонитрил, хлористый метиле и, хлороформ, нитрометаи).

Дальнейшее усовершенствование фосфотриэфирного метода, позволившее проводить межнуклеотидную конденсацию за 1 — 2 мин, основано на использовании в качестве конденсирующих реагентов арилсульфохлоридов в присутствии 4-замещеиных производных N оки ей пиридина и хинолина

X X

О о

X = N(CH3b; N(С2НБ)Г; N(CH3) ОСНзСН? - (морфолиио); NfCH^jTCHj — (пипвридиио ); NtCi-ЦЬСНг —(пиррояидино):

ОСНз; ОС2К,; ОСН3С6Н5

Фосфитный метод. Широкое применение в последнее время получил фосфитный способ синтезе олигонуклеотидов (с. 366). Фосфитиое производное (8) может содержать в качестве замести-

364

Нуклеиновые кислоты

H,c-cf°

I >

„ H,c-r/ (MeObTrOCHj^j ЕГ %

(МвОЬТ.ОСН, о в

[МеО|2ТЮСН2 в"

О

С —CHj-CH2—С —NH— Р

II II

О о

V?1

С— СН5-СН,— С— О"

I II

•о о

о

I

с-

II

о

II

о

1) (MeOhTr-

2) Конденсирующий реагент

О I

о=р

I

ОСвН4С'.

[МеО)2Т. ЭСН2 „ в"

о

оЛ-

I

OCeH CI

1) NH, Н-

2) н* ^_

¦осн2 „ вг

о=р—

I

он

--ОСН2

К

С—СН2—СН3—С—NH— р II II

В"=т, bzA, алС или ibG п = 1-э

Рис. 203. Твердофазный фосфотриэфирный метод синтеза олигонуклеотидов (фосфатный вариант).

теля галоген, тетразол или вторичный амин (в последнем случае 365

метод называют фосфамидитным). В результате конденсации обра---

зуется динуклеотид метоксифосфин (18), который может быть Синтез нуклеиновых кислот

далее окислен в мягких условиях с образованием фосфотриэфира (19). Наиболее эффективен фосфитный метод в твердофазном синтезе олигонуклеотидов (рис. 204).

Синтез на полимерных носителях. Так же как и в случае полипептидов, синтез олигонуклеотидов может быть осуществлен ступенчатым удлинением цепи, ковалентно привязанной одним из концов (5' или 3') к полимерному носителю. Синтез олигонуклеотидов на полимере начал развиваться в 60-х годах усилиями ряда групп: Ф. Крамера (ФРГ) и Г. Кораны с сотр. (США), 3. А. Шаба-ровой, М. А. Прокофьева с сотр. (СССР). Такой подход принципиально более эффективен, чем синтез в растворе, так как существенно облегчается отделение продукта от исходных веществ, что приводит к сокращению времени синтеза. Кроме того, все операции легко могут быть автоматизированы (первые автоматические системы были предложены М. Гайтом и М. Карузерсом). Принципиальная схема синтеза на полимерном носителе выглядит следующим образом:

Для осуществления таким способом синтеза достаточно длинных полимеров необходимы высокие выходы на каждой стадии конденсации. Существенным фактором успеха при твердофазном синтезе является также качество полимерного носителя, который должен быть инертным, содержать стерически доступные функциональные группы для присоединения первого звена, иметь достаточный размер пор, чтобы обеспечить свободную диффузию реагентов, и, наконец, иеспецифически не связывать реагенты и продукты.

366 Найден целый ряд полимеров, удовлетворяющих этим требо-

- ваниям. К их числу относятся полиакриламид, полнакрилморфолид.

Нуклеиновые кислоты полидиметилакриламид, полистирол, силикагель, пористое стекло,

бумага и т. д.

Синтезы олигонуклеотидов с использованием фосфатного и фос-фитного фосфотриэфирных методов приведены на рисунках 203 и 204. На первой стадии нуклеозид присоединяют с помощью якорной группы к полимерному носителю. Затем его 5'-гидроксильную группу деблокируют кислотной обработкой и конденсируют с нуклеотидный компонентом. У образующегося полиостью защищенного ди нуклеозид монофосфата удаляют диметокситритильную группу и присоединяют следующий нуклеотид и т. д. На последней стадии продукт отщепляют от полимерного носителя, снимают защитные группы и очищают хроматографией или электрофорезом н полиакриламидном геле.

Фосфотриэфирный и фосфитный методы дают высокие выходы на каждых стадиях синтеза и с успехом используются для синтеза олигонуклеотидов иа полимерных носителях.

В настоящее время существуют синтезаторы олигонуклеотидов, работающие по заданной программе.

Синтез полирибонуклеотидов

367

Синтез нуклеиновых кислот

Си нтез сравнительно коротких оли горибонуклеотидов может быть осуществлен химическим или ферментативным методом. Более длинные последовательности получают путем соединения коротких фрагментов с помощью РНК-лигазы.

Ферментативный синтез олигорибонуклеотидов. Как правило, для синтеза сравнительно коротких фрагментов — ди- и тетраиук-леотидов используют реакцию, катализируемую рибоиуклеазами:

N

(20)

6

—он

OR

N1 (21)

N)

о' V

N1

—он

-OR

R Н или о лиг ор ибо ун еогид

Эта реакция обратна реакции гидролиза и заключается во взаимодействии 2\3'-рибонуклеозидциклофосфата (20) (нуклеотидный компонент) с 5'-ОН-группой рибонуклеозида (21) (нуклеозидный

В,

—он —он —он

о о —он

Nil N11

р р

N 'N

он он

-ос—сн—сн он

(22) В,

N1 (23)

,сн3 ^сн,

—он —он —он о II ^сн, —ос—сн—сне ^-сн,

о IN о |\ о N11 IN —ОН

—он —он —он

о о о

ч? \|| р Ч!

IN |\ IN

-он -он

R- н или олигорибонунлеотия

368

Нуклеиновые кислоты

компонент). В качестве нуклеотидного и нуклеозидного компонентов выступают как мономеры, так и олигонуклеотиды. При использовании неспецифических рибонуклеаз (таких, как РНазы из Bacillus subtil is или Penicillium brevicompactum) природа оснований В| и Ва не очень существенна. Могут быть применены и специфические РНазы, например гуанилрибонуклеаза (РНаэа т|), если В[ представляет собой гуанин, или панкреатическая РНаза для пиримидиновых оснований. При увеличении длины синтезируемого продукта все большую роль играет его гидролиз РНазами. В таком случае для наращивания цепи выгодно использовать специфические РНазы, неспособные расщеплять уже имеющуюся цепь. Помимо рибоиуклеаз, для ферментативного синтеза олигонуклеотидов находит применение поли ну клеотидфос форила за (ПНФаза), Для того чтобы фермент присоединял только одно звено к З'-концу олигонуклеотида затравки (22), одну из гидроксильных групп дифосфата (23) блокируют объемистым ацильным заместителем, который после реакции удаляют мягкой щелочной обработкой.

Синтез олигорибонуклеотидов может быть осуществлен комбинацией РНаз и ПНФазы.

Химический синтез олигорибонуклеотидов. Оли гори бону клео-тиды синтезируют фосфодиэфирным, фосфотриэфирным и фосфит ным методами с использованием в осиоаном аналогичных приемов и реагентов, описанных для ДНК-ряда. Дополнительной проблемой является необходимость избирательной защиты 2'-ОН-группы рибозы. а также лабильность фосфодиэфирной связи олиго- и поли-рибонуклеотидов в щелочной среде.

Фосфодиэфирный метод был использован Г. Кораной для синтеза всех ди- и три рибо нуклеотидов при установлении генетического кода. Пример получения рибодинуклеозидмонофосфата с применением фосфодиэфириого способа дан на схеме:

Рис. Д)5. Структура дрожжевой ала пи-новой тРНК, полученной химико-ферментативным синтезом.

[МеО)2ТгО.

НО

N]

—OR

N

ва

-ОН

-он

-Or ArSOaCl

(MeO)«TrO.

ч

в?

OR

— OR

N

N

в

33 ный раствор NH4OH

N

1н«

I в?

—OR

ч

ч

N

-OR

—OR

^° -^О R=CH3C^ или CeHsC^

Рассмотрим один из примеров синтеза защищенного рибонук- 369

леозидмонофосфата (24) с помощью фосфотриэфирного метода.---

В этом случае с целью защиты 5'-гидроксильной группы использо- Синтез нуклеиновых кислот

вана о-дибромметилбензоильиая защита, которая легко снимается действием ионов серебра, а 2'-гидроксильная группа рибозы блокируется неустойчивой в кислых условиях метоксипиранильной группировкой. Остальные защитные группы и конденсирующие агенты ие отличаются от используемых в синтезе олигодезоксирибонуклеотидов

Одним из примеров синтеза природных рибополинуклеотидов является полный химико-ферментативный синтез дрожжевой алаииновой тРНК (рис. 205), осуществленный большой группой

Cml 4'GGG AG AG GUCUCCGGT4'CG

AUUCCGGACUCGUCCACCA- P

I [Y-32P]ATP

киназа ( PSET 1 ]

'P—AUUCCGGACUCGUCCACCA—P

T

T4 РНК - лнгаза

GUCUCCGGTVCGAUUCCGGACUCGUCCACCA—P

I [V-'2P]ATP

I киназа [PSET 1 ]

•P—GUCUCCGGTM'CGAUUCCGGACUCGUCCACCA—P

CmI'l'GGGAGAGGUCUCCGGT4rCGAUUCCGGACUCGUCCACCA—P

I [Y-S2PlATP I киназа

P-CmlTCGGAGAGGUCUCCGGTVCGAUUCCGGACUCGUCCACCA

Рис. 206. Химике-ферментативный синтез ^ вины дрожжевой ала чин вой тРНК (нуклеотиаы 36—76).

370

Нуклеиновые кислоты

китайских химиков под руководством профессора Ван Иньлая. Отличительной особенностью синтеза явилось то, что синтетическая тРНК содержала минорные нуклеотиды. Для синтеза 76-иуклеотид-ная последовательность тРНК была разбита на 6 олиго нуклеотидных сегментов величиной от 9 до 19 звеньев. Синтез этих сегментов был проведен фосфотриэфирным методом, полученные олигонуклеотиды далее «соединялись» друг с другом при помощи Т4 РНК-лигазы, как показано на рисунке 206. Изучение биологической активности синтетической тРНК показало, что она обладает полной активностью природной дрожжевой аланиновой тРНК в реакциях аминоацилирования и образования пептидной связи на рибосоме.

Химико ферментативный синтез фрагментов ДНК

Рис 207, Общая стра re I и я синтеза двух-ц н и ДНК.

Комплекс современных методов синтеза нуклеиновых кислот позволяет исходя из мононуклеотидов получать гены, кодирующие белки длиной более 100 аминокислотных остатков. Первым этапом работы является химический синтез олиго дезоксирибонуклеотидов, которые затем с помощью ферментов нуклеинового обмена, таких, как Т4 полинуклеотидкииаза, Т4 ДНК-лигаза и ДНК-полимеразы, превращаются в двухцепочечные фрагменты ДНК (рис. 207). Мето-

(0

а-**

ОН з

,.,-с-г-с А-л.с.г Т-т-°-т-сз^-л-т-«-т С^

т-' ,„ онз а-с-а-с т-т-Г-А-С * G

' (5) 1 , (6)

01 ОНЗ

с_с-о-с-о-с-л_е_;

—Тип он V ' -1.

5'ОН

А-«"

ОН 3

1'НО р

ЩШ^^ 1"*»-? г-

..х-1 533f он з *-с -

но онз

I т—;— (7)

5 НО ОН 3

о инунлеотид киназа дли всем

ир ме ОН З'

• 3'Н0МР __C.C-G-C-G-C-A-G,|

-е-»-г-а

ОН 5

ОН 5'

с-с-е-г-с.д

51ар ОН 3 Т~' -

а-, а

i

ОН 5"

i-v-e-A T-T-G-T-G-A-A-A-T-G-T C-G-C-C-G-C-G-C-A-G-]

С VA-C-G-T-A-A-C-A-C

C-G-C-G-T-C.A-T-T-T-G.A-T-A

Р ОН 5'

цология сборки синтетических олнгомеров в протяженные дуплексы впервые была предложена в конце 70-х годов Г. Кораной н сотр. и долгое время оставалась практически неизменной. Разработанный ими подход (рис. 208, а) состоит в многократном последовательном соединении при помощи Т4 ДНК-лигазы 10 — 20-звенных олигонуклеотидов с комплементарными, взаимно перекрывающимися последовательностями оснований сначала в небольшие дуплексы с выступающими одноцепочечными последовательностями на концах, а затем — в целый ген, который клонируют в векторной молекуле (см. с. 431). Этим способом был получен целый ряд полинуклеотидов, в том числе гены некоторых интерферонов человека, с длиной более 500 п. о.

371

Синтез нуклеиновых кислот

Химический синтез коротки» дезоксирибонуклеотидон

1

Ферментативное фосфорилирование концевых 5'-- ОН групп... (б)

Репаративная достройка

Катализируемое лигазои соединение олигонуклеотидов Синтетические олигонуклеотиды

Т4 ДНК - лигвэа

ДНК — п о ли мер д за А i

^Рестр

1. Вектор ¦ Т4 ДНК - лигвэа

2. Клонирование

3. Рестрикция

Синтетический дуплекс

I

Клонирование

С развитием методов синтеза олигонуклеотидов стало возможным получать чисто химическими способами 30 — 60- и даже 100 звенные олнгомеры. С одной стороны, это привело к упрощению описанной методологии (за счет существенного сокращения числа лигазных реакций при сборке гена), а с другой — создало основу для разработки принципиально иного подхода к получению синтетических дуплексов. Такой подход, предложенный К. Итакура и сотр., заключается в репаратнвной достройке с помощью ДНК-полнме-

Рис. 208. Два подхода к получению двухцепочечных полинуклеотидов методами химико-ферментативного синтеза: а — использующий для соединения отдельных фрагментов реакцию, катализируемую Т4 ДНК-лигазой; б — с применением репаратнвной достройки частичного дуплекса с помощью ДНК-полимеразы (•—5 фосфорил и решенный олигонуклеотид; -олигонуклеотид, не

имеющий фосфатной группы на 5'-конце).

372

Нуклеиновые кислоты

разы Е. coli частичного дуплекса, образованного 3'-концевым и последовательностями двух длинных олигонуклеотидов, в полностью двухцепочечный фрагмент ДНК. Последний после образования на одном из его концов «липкого» свита (действием соответствующей рестриктазы) соединяется в составе векторной молекулы с другим, аналогично синтезированным дуплексом (рис. 208, б). Одним из примеров применения этого способа явился синтез фрагмента гена человеческого лейкоцитарного интерферона а? длиной 132 п. о.

Хотя первый из описанных выше подходов теоретически пригоден для построения генов любой длины, на практике по мере увеличения числа последовательных лигазных «сшивок» становится все труднее очищать продукты реакции и получать нх а достаточном для дальнейшей работы количестве. Кроме того, увеличивается расход исходных синтетических олигонуклеотидов. В то же время второй подход пригоден только для получения фрагментов длиной не более 200 — 250 п. о. В связи с этим для облегчения сборки гена (очистки гррагментов и экономии нуклеотидного материала) более целесообразно составлять его из отдельных модулей, предварительно очищенных промежуточным клонированием.

Корана IKhoranal Хар Гобннд

(р. 1922), американский биохимик, иностранный член АН СССР (1971). Образование получил в Пенджабском и Ливерпульском университетах, с 1970 г.— в Массачусетсом технологическом институте. Основные работы— в области синтеза нуклеиновых кислот. Внес большой вклад в расшифровку генетического кода. Впервые синтезировал ген аланиновой тРНК (1970) Выполнил ряд важных работ го структуре мембранных белков. Лауре-ат Нобелевской премии по физиологии и медицине (196S, совместно с Р. Хол-ли и ДА. Ниренбергом).

Клонирование синтетических полидезоксирибонуклеотидов

Одним из этапов синтеза искусственных двухцепочечных фрагментов ДНК является их клонирование в составе много копи иного вектора с тем, чтобы синтезированная последовательность сохранялась и при необходимости моглв быть наработана в достаточных количествах. С этой целью синтез двухцепочечных фрагментов осуществляют таким образом, чтобы они содержали на концах участки, идентичные получающимся при расщеплении ДНК определенной рестрикционнон эндонуклеазой. В квчестве примера на рисунке 209 приведена последовательность фрагмента ДНК, кодирующего короткий нейропептид — лейцин-энкефалнн. Наряду с собственно кодирующей последовательностью фрагмент содержит инициирующий ATG (присоединенный к ней для обеспечения инициации трансляции) и терминирующий ТАА кодоны, в также выступающие одноцепочечные последовательности, соответствующие тем, которые образуются на концах ДНК при действии

страница 49
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(01.05.2017)