|
|
Биоорганическая химияpApGpGOH + 32pNp АТР Мд2* РНН-лип .pApGpG'^pNp ррА 5'pGpCpT 354 Нуклеиновые кислоты Химический синтез олигонуклеотидов Ключевой стадией химического синтеза олигонуклеотидов является создание фосфодиэфирных связей между нуклеотидами. Можно выделить два основных подхода к решению этой задачи. Один из них использует в качестве источника фосфатной группы моноэтерифицирова ные фоефа ы (фосфомоноэфиры) а другой — диэтерифииированные фосфаты (фосфодиэфиры). В первом случае при химическом синтезе непосредственно образуется фосфодиэфирная связь, а во втором — получается три-эфир фосфорной кислоты,-который затем при полном деблокировании превращают в диэфир. Поэтому первый метод иосит название фасфадиэфирного, а второй — фосфатриэфирного. Одним из распространенных вариантов фосфотрнэфирного метода является фосфитный метод, в котором на первом этапе образуется фосфитный тризфир, окисляющийся затем а триэфир фосфорной кислоты Фосфод и эфирный метод О ROH НО—Р—OR I О Нуклеоэидный компонент Нуклеотидный компонент Фосфотриэфирный метод О II ROH О—Р—OR Фосфитный метод О -КО—Р—OR - I , OR фосфотрихфир о II - RO—Р—OR I о фосфодмхфир ROH • X—Р—OR1 ——RO—Р—OR' I , 1 2 OR ORJ Фосфитный триэфир R. R1 остатки нуклеозидов R3 эашнтные группы N ,0 Защитные группы. Поскольку нуклеозиды и нуклеотиды — полифункциональные соединения, все реакционноспособные группы, кроме тех, которые должны вступать в реакцию конденсации, необходимо блокировать, чтобы избежать нежелательных побочных реакций. Защите подвергаются экзоциклические аминогруппы гетероциклических оснований, гидроксильные группы дезоксирибозы и, в случае фосфотриэфирных методов, один из двух фосфатных 355 гидроксилов. Основными требованиями к защитным группам явля- - юте я стабильность в условиях конденсации, возможность введения Синтез нуклеиновых кислот и удаления без деструкции и модификации исходных и конечных продуктов и, наконец, возможность селективного удаления одних защитных групп при сохранении других. Основные защитные группы, применяемые в синтезе олиго-нуклеотидов, приведены в таблице 14. Аминогруппы оснований и З'-гидроксильные группы дезоксирибозы защищаются путем ацилирования. Наиболее распространенными защитными группами при этом являются ацетильная — для З'-гидроксила углевода, бензоиль-ная — для аминогрупп цитидина и аденозина, аиизоильная — для аминогруппы цитидина и нзобутирильная — для аминогруппы гуанина. Все ацильные защитные группы могут бытьдоалены действием концентрированного водного аммиака. Для блокирования 5'-гидроксильных групп обычно используют производные трифенилметана. которые легко удаляются действием кислот, в том числе и апротониых кислот Льюиса. Фосфатная группировка защищается р,-циаи;1тильной группой, которая может быть снята обработкой щелочью. В фосфотриэфир-ном методе в качестве второй Р-защитной группировки используют п- или о-хлорфенильные группы. Для их элиминирования применяются аммиак или ароматические альдоксимы. Две другие задачи, возникающие при создании фосфодиэфирных связей, состоят в выборе рациональных методов введения фосфатных групп в нуклеозиды и способов конденсации иуклеозидного и нуклеотидного компонентов. Фосфорилирование нуклеозидов. В синтезе олиго ну клеоти дон разработаны два пути фосфорилирования нуклеозидов. В одном из них используются стабильные производные фосфорной кислоты, содержащие высокореакционно пособную группировку. В другом такая группировка создается прямо в процессе реакции за счет взаимодействия производного фосфорной кислоты с активирующим реагентом. В обоих случаях фосфорилирование гидроксильных групп сахара проходит в результате нуклеофильного замещения у атома фосфора фосфорилирующего компонента. OR1 О RJ\ flN> ~*k-°-p-ok'+xh OR Первый путь реализуется, например, при взаимодействии окси хлорида фосфора с нуклеозидами, при этом с максимальной скоростью фосфорилируется 5'-ОН-группа. Первичный продукт реакции, содержащий связанные с фосфором атомы хлора, гидролизу етс я водой: N -, О-н Р Защитные группы, используемые в синтезе олигонуклеотидов № п/п Защищаемая группа Защитная группа Формула Сокра щення Условия отщепления 1 -NH, Ацетильная СН.-С- II ас Конц. NH, 2 Бензонльная о С.Н.-С- bz 3 Аннзонльнав: о СНвО-С4Н4-С- an 4 - Иэобутнрнльная о >н-с-™. о ib 5 б 7 5'-ОН Трнтильная Монометокси- тритнльная Диметокситри- тильная (С.Н,),С- СН10-С,Н.(С,Н,),С-(CH,0-C.HJ,(C.H,)C- Т* 1 МеОТг (МеО),Тг Бензопсульфо ккслота> три хлоруксусная кислота, три-фторуксусная кислота, ZnBr, 8 Трнтнлоксиацс-тильнжя (С.Н,),СОСН,С- о Тгас Раэб. N11, 9 Леаупнн ильная СН.С-СНХН.-С- II II О о Lev NH.NH, 10 « о ДиСромметнл Бензоильнал СНВгг OV DBMB AgCIO, 11 З'-ОН Бензонльная о с.н.-с-II о Bz Конц. NH,, NaOH 12 Ацетильная сн.-с-II о Ac 13 2'-ОН Тетрагидропи-ранильная -о Thp Разб. НС1 14 Метокситетрагид ропнраннлъная Mthp •' 15 16 Фосфатная (5 Цианэтнл 0,0,0-Трихлор этипьная N=t-CH,-CH, С1\ С1-С-СН,- CNEt TCEt NH„ NaOH, три этил а мин H./Zn-Cu 17 18 (п ) илн о-Хлор-феннльная Анилидная и замешенные аннлидныс CI (С1)-^-Q-NH- [CH.OI-^^-NH- CIPh NH„ разб. NaOH, син 2 шггро-Бенэальдегид илн пиридин карбальдегил Иэоамил нитрит В более жестких условиях при замещенной 5'-ОН-группе анало- 357 гичным образом можно получить З'-фосфаты. -¦—------- Для фосфорилирования гидроксильных групп остатка рибозы Синтез нуклеиновых кислот или дезоксирибозы используют также активированные фосфамиды, например фосфотри-(1) и тетразолиды (2), которые получают взаимодействием хлорфосфатов с триазолом или тетразолом. Эффективные фосфорилирующие реагенты (3) образуются также при действии 1 экв. НгО в пиридине иа арилдихлорфосфаты. r'=H; ra=ci или R2=H; R'=CI (3) Как уже было отмечено, фосфорилирование нуклеозидов осуществляется также производными фосфорной кислоты в присутствии активирующих агентов, в роли которых могут выступать дици-клогексилкарбодиимид (DCC) или арилсульфохлорины ArSO CI И в том и в другом варианте на первом этапе реакции происходит активация фосфатной группы с образованием промежуточных соединений, приведенных ниже 0 nr1 о nr1 II II II II RO—Р—ОН + С -— RO—Р —О—С 1 I" , РУ I ОН nr1 ОН nhr' О О II II RO—Р—ОН + CISOjAr -RO—Р— OSO.Ar I рУ I ОН ОН R _ остаток нуклеозида R'-CgH,, 358_ о r'och. ^ в rock. л в Нуклеиновые кислоты P_q_р_ I он f ОН + \l l/l f™~ *'50..СГ) \] |/ он П гТ он о I о-р—or I он Механизмы дальнейш и х.п ре вращений этих соединений сложны, но в конечном счете происходит нуклеофильное замещение в фос-форилируюшем агенте, причем роль муклеофила играет защищенный нуклеозид со свободной гидроксильной группой. В понимание механизмов активации существенный вклад был анесен Д. Г. Кнорре. ТриизопропилбензолсульсроклориД R— N-эа ит ые группы В*—N-защищенное гетероциклическое основание Недостатком карбодиимидного метода является малая скорость реакции и образование большого числа побочных продуктов. Использование арилсульфохлоридов позволяет избежать побочных реакций. В качестве активирующих агентов могут выступать арил-сульфотри или тетразолиды. Вероятно, в этом случае активными фосфорили*рующими соединениями являются образующиеся а результате реакции фосфотри- и тетразолиды. В качестве примера приведены даа пути получения фосфорили-рованного производного (4) — ключевого соединения в фосфотри-эфирном методе. Первый из ннх включает обработку исходного нуклеозида (5) бис- (триазолидом) п-хлорфенилфосфорной кислоты с последующим превращением промежуточного продукта (7) в триэфир (4) действием этилеициангидрнна. Второй — получение диэфира нуклеотида (6), а затем превращение его в триэфир (4) с помощью конденсирующего агента. В последние годы в связи с разработкой фосфитного варианта фосфотриэфирного метода синтеза олиго нуклеотидов все большее значение приобретаю! методы введения а нуклеотиды производных фосфористой кислоты с образованием соединений типа (8) 359 Синтез нуклеиновых кислот ИД (МеО) ТЮСН2 ОН н (МеО)2ТгОСН2 R'O с? (5) R—N-защитные группы X CI или N[CH(CHa),|s (8) Кнорре Дмитрий Георгиевич (р. 1926), советский химик и биохимик, академик АН СССР (19В1). Окончил Московский химико-технологический институт им. Д. И. Менделеева (1947)- Директор Института биоорганической химии СО АН СССР (Новосибирск) и профессор Новосибирского университета. Основные работы посвящены изучению направленной химической модификации нуклеиновых кислот и белков, механизма пептидного синтеза. Фосфодиэфирный метод синтеза олигонуклеотидов. Согласно использовавшейся ранее методологии, разработанной в лаборатории Г. Кораны, фосфодиэфирный метод включает в себя конденсацию нуклеозидного компонента с незащищенной З'-ОН-группой (S) с нуклеотидным компонентом, имеющим свободную 5'-фосфомоно-эфирную группу (9) (рис. 201). В качестве конденсирующих агентов применяются арилсульфо-хлориды или DCC. Образующийся защищенный динуклеозидмоно-фосфат (10) либо полностью деблокируется, либо в нем удаляется только ацильная группа, блокирующая З'-гидроксил. В последнем случае образуется ди ну клеозид монофосфат (И) со свободной З'-ОН-группой, используемый в качестве нуклеозидного компонента для присоединения следующего звена. Метод синтеза, при котором на каждом последующем шаге присоединяется мономерное звено, называется ступенчатым. Обычно таким образом синтезируются не более чем 3 — 4-звенные олигонуклеотиды, что связано с трудностями отделения продукта конденсации от исходного олигонуклеотида по мере увеличения длины цепи, поскольку они различаются всего на одно звено. Для синтеза более длинных олиго нуклеотидов используют блочный метод. К динуклеотиду со свободной З'-гидроксильной группой (II) MeOTrOCB, ^ Bl МеОТгОСНг0 В' МеОТгОСНг„ В! НО Аг50гС1(ияи DCC) о О + Р» О—Р—О 0=Р—ОСНг В" I ОН I о=р—о (») (10) ОСНг0 Вг l\| I/ Ч—Г N_Г вг в; о м (11) (II) NC(CH2)20—Р—ОСН2 Вз NC(CH2)20—Р—ОСН2л B5 НО—Р—ОСНг в3 о ^ а - |^ а- |ф| о I о=р—осн>„ в; а, Ру 0=Р—О ЧАсгО 0=Р—О осн2 в; осн!_ в; АсО * 1" Е ; —ОАс
ноч 1\ О" (12) (12) В* В' в* в; MeOTrOx N о О—Р—о, о II р IN в* в; в" в; ¦--Nj Г а- ° (11) (12) В — bzA; anC; jbC или Т —ОАс МеОТЮ а^ Bi в в l)NH, . —ОАс N но\ К» ч| а^ 2 Из «М N N о о- ArS02CI=TPSCI или Н3С СНз / V-1-с. СНз Me л и типе нс у л фо н лори д Рис. 201. Общая схема синтеза тетра-нуклеотида фосфодиэфирным методом. (нуклеозидный компонент) присоединяют динуклеотид с незащищенной 5'-фосфатной группой, но защищенным З'-гидроксилом (12) (нуклеотидный компонент). Однако и при использовании блочного метода синтез сравнительно длинных (более 10—12 звеньев) олигонуклеотидов фосфо-диэфириым методом оказывается затруднительным в связи с многочисленными побочными реакциями с участием незащищенной фосфатной группы. Существенный прогресс в синтезе олигонуклеотидов, позволивший получать длинные последовательности, связан с применением усовершенствованного фосфотрнэфирного метода. Фосфотриэфирный метод синтеза олигонуклеотидов. Фосфотри-эфириый метод является исторически более ранним методом синтеза олигонуклеотидов. Именно таким путем А. Тоддом и М. Ми-кельсоном был получен первый синтетический олигонуклеотид. Однако широкого распространения метод не имел ввиду отсутствия достаточно эффективных защитных групп и конденсирующих агентов С появлением соответствующих реагентов фосфотрнэфир ный метод и его варианты практически заменили фосфодиэфирный метод. В современном фосфотриэфирном методе используется ключевое соединение (4) которое легко может быть превращено как в нуклеозидный (13), так и нуклеотидный (14) компоненты. 5 Диметокситритильная группа избирательно удаляется действием слабой кислоты (например, бензолсульфокислоты в хлороформе или с помощью бромистого цинка), р-цивнэтильная группировка — действием щелочи, при этом о- или п-хлорфеннльная группа остается в иуклеозидном и нуклеотидном компонентах в качестве защиты для межиуклеотидного фосфата. В* о II у О—Р—О—CH2_CH2CN ' О (13) (14) 361 Синтез нуклеиновых кислот Тодд (Todd) Алексеи дер Роберту с (р 1907), английский химик органик и биоорганик Образование получил В университетах Глазго и Франкфур-та-нв-Майне (1931), с 1944 г.— профессор Кембриджского университета. Автор фундаментальных трудов по изучению структуры нуклеиновых кислот, синтезу витаминов. Синтезировал (1936) витамин В|. Совместно с Д. Брауном предложил общую схему строения РНК. Лауреат Нобелевской премии по химии (1957). R—N— защитная группа -О—Р—о Конденсирующий —О—Р—ОСИ СН CN (MeO)2TrCKj OCH.CI HO-J OC„H,CI (14) (13) (МеО).ТгСК ч (МеО)ТЮ-ч О II —О—Р—0(CH..)..CN I OC„R,CI —О—Р—OCHiCI I ' 0(CH,);.CN (MeO)TrCK О—Р—0(CH)CN I ООН CI C.H.CI Конденсирующие агенты, используемые ¦ гриэфирмом методе: \=/ У \ (MSNT) Меэитиленсульфо - 3 ннгро — I, 2, 4 - триазолид [TPS—Те) Трииэопропилбензолсульфо-твтреэолнд TPSCI + Н,С—N (Melm) N - Метилимидаэол Рис. 202. Фосфотриэфирный метод синтеза олигонуклеотидов. При конденсации нуклеозидного (13) и нуклеотидного компонентов (14) образуется полностью защищенный динуклеозид-монофосфат (15). Дальнейшее удлинение цепи (так же как и в ди-эфирном методе) может идти ступенчатым или блочным методом (рис. 203). В первом случае в качестве нуклеозидных компонентов выступают оли го нуклеотиды с 5'-концевой незащищенной гидро-ксильной группой, а в качестве нуклеотидных — моно нуклеотиды с незащищенной З'-фосфодиэфирной группой. Цепь обычно наращивается от 3'- к 5'-концу. Во втором случае и нуклеозидным и нук-леотидным компонентами служат оли го нуклеотиды, подобные (16) и (17), Фосфотриэфирным способом удается стабильно получать 15 — 20-звенные оли го нуклеотиды. а также более длинные поли-нуклеотиды, вплоть до 50 — 60-звенных. В качестве конденсирующих реагентов в фосфотриэфирном методе ранее чаще всего применялись арилсульфоазолиды: 4-нитро-имидазолиды, 1,2,4-триазолиды, 3-нитро-1,2,4-триазолиды и тетрв-золиды (рис. 202). В то же время хорошо зарекомендовавшие себя в диэфирном методе синтеза арилсульфохлориды оказались неэффективными из-за медленного протекания реакции и низкого выхода целевого продукта. Однако в ходе недавних исследований (В. А. Ефимов, О. Г, Чахмахчева) по синтезу олиго- и полинуклеотидов было обнаружено, что в присутствии некоторых иуклеофиль-ных катализаторов арилсульфохлориды оказываются значительно более эффективными конденсирующими реагентами для создания фосфотриэфирной связи, чем самые активные из арилсульфоазо-лидов Одним из таких иуклеофильных катализаторо |
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 |
Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb) |
[каталог] [статьи] [доска объявлений] [обратная связь] |