Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

роматина. Хотя гипотеза не была прямо подтверждена экспериментально, она породила целый ряд гипотез о способах образования «кинков» в двуспнральных ДНК и нх роли во взанмо-

Рис. 200. Схема образования «киикон в ДНК fa). Образование «кинков* в ДНК (б).

1 — р-«кинковая* структура ДНК;

2 р-«кинковая* компьютерная структура ДНК;

3 компьютерная структура ДНК в В-форме;

4 — молекулярная модель ДНК в В-форме.

348 действии с интеркалирующими красителями и белками, содержа-

щими способные к ннтеркаляции ароматические аминокислоты.

Нуклеиновые кислоты Эти гипотезы сводятся к тому, что в момент образования «кинка»

интеркалирующее вещество способно внедряться между парами оснований, которые удаляются друг от друга в месте излома. Иногда предполагают, что возникновение «кинков» предшествует плавлению двух цепочечных полинуклеотидов.

Корнберг (Kornbergl Артур (р. 191В), американский биохимик. Окончил Ро честерский университет (1941). Внес значительный вклад в изучение биосинтеза белков. Открыл фермент Д К-полимер у с помощью которого синтезировал биологически активную молекулу ДНК. Лауреат Нобелевской премии по физиологии и медицине (1959, совместно с С. Очоа).

Синтез нуклеиновых кислот

В настоящее время методы синтеза олиго- #и полинуклеотидов разработаны в такой степени, что в короткие сроки могут быть получены искусственные фрагменты ДНК большой длины и практически любого состава. Достигнут существенный прогресс и в синтезе полирнбонуклеотидов. Общая стратегия синтеза полинуклеотидов и нуклеиновых кислот заключается в комбинированном использовании химических и ферментативных методов. Относительно небольшие олигонуклеотиды синтезируют химически, а затем «соединяют» в длинные цепн с помощью соответствующих ферментов.

Синтетические олиго- и полинуклеотиды, а также полученные синтетическим путем гены и регуляторные области (промоторы, терминаторы и т. д.) широко используются в нсследованнн структуры н функции нуклеиновых кислот, генетической и белковой инженерии, биотехнологии. Синтез олиго- и полинуклеотидов, представляющий собой важный раздел биоорганической химии, имеет сегодня большое теоретическое и прикладное значение.

Ферменты биосинтеза нуклеиновых кислот

В этом разделе рассматриваются основные грерменты биосинтеза нуклеиновых кислот, поскольку многие нз них широко используются в химико-ферментативном синтезе полинуклеотидов. Среди этих грерментов особый интерес представляют полимеразы и лигазы.

ДНК-полимеразы. ДНК-полимеразы относятся к типу грерментов, образующих фосфодиэфирные связи н использующих в качестве субстрата дезоксинуклеозндтрифосфаты (dNTP). Необходимым условием работы таких грерментов, как правило, является наличие матрицы и затравки. Матрицей служит одно цепочечная ДНК, и ДНК-полимеразы ее копируют, синтезируя комплементарную полидезоксирибонуклеотидную цепь. Синтез не может начаться без затравки, представляющей собой олиго- или полинуклеотид, комплементарный матрице и имеющий свободную З'-ОН-группу, с которой начинается присоединение первого нуклеотида вновь синтезируемой цепи

Синтез нуклеиновых кислот

Таким образом, фермент выполняет функцию отбора нуклеозид-трифосфатов, комплементарных каждому следующему звену матрицы, и катализирует нуклеофнльную атаку З'-ОН-группы затравки на сс-фосфатную группу трнфосфата:

ОН

° с/

в, В? в, II/ в' В в в3 в,

После присоединения каждого нового звена удлиненная цепь содержит на З'-конце свободную гндроксильную группу, к которой может присоединяться новое звено. Процесс продолжается, пока ДНК не станет полностью двухцепочечной. Новая цепь растет в направлении от 5'- к З'-концу, а матрица «учитывается» в направлении от 3'- к 5'-концу.

Вышесказанное относится к общим свойствам всех матрнчно-зависимых ДНК-полнмеризующих ферментов. Однако ферменты из разных источников обладают и индивидуальными особенностями.

350

Нуклеиновые кислоты

Тсмин (TemlnJ Говард (р. 1934), американский вирусолог. Окончил Калифорнийский технологический институт н Пасадене (1959), с 1971 г — заведу ющий лабораторией в Вис ко не и не ном университете в Милуоки. Основные работы— по изучению РНК-сод ер жащих вирусов. Обнаружил в вирусах саркомы Рауса ферментную систему, способную синтезировать ДНК на матрице РНК (1970 независимо от Д. Балтимо ра) Лауреат Нобелевской премии по физиологии и медицине (1975, совместно с Р Дульбекко и Д. Балтимором)

Так, ДНК-полимераза I из Е. coli (открыта А. Корнбергом), помимо полнмеразной активности, обладает еще двумя типами экзонуклеазной активности: как 5' У-экзонуклеаза она осуществляет с 5'-конца двухцепочечных ДНК деградацию, в результате которой происходит отщепление 5'-моно- и 5'-фосфорилированных коротких олигонуклеотидов, а как 3' -+ 5'-зкзонуклеаза последовательно отщепляет 5'-мононуклеотиды с З'-концов двухцепочечных и одноцепочечных ДНК. Фермент работает в присутствии ионов Mg2

При мягком протеолнтнческом расщеплении субтнлизином ДНК-полимераза I дает два полипептнда, один из которых обладает только 5' -* У-экзонуклеазной активностью, тогда как другой сохраняет полимеразную и У -* 5'-экзонуклеазную активности. Последний фрагмент носит название большого фрагмента ДНК-полимеразы I или фрагмента* Кленова.

ДНК-полимеразу I и фрагмент Кленова широко используют в генной инженерии н при анализе структуры ДНК для «заполнения» 5'-высгупающих одноцепочечных концов или для удаления 3'-выступающих концов. В первом случае эти ферменты проявляют ДНК-полимеразную активность, а во втором.— У 5'-экзонук-леазную. Прн заполнении выступаюших концов содержащими радиоактивную метку нуклеозидтрифосфатами ДНК оказывается меченной по концевым звеньям:

5". . -pApGoH

3'. . рТрСрТрТрАрАр ¦

Р«[а*Р]

РР рА + РРрТ

-pApGpApApTpT 3' . рТрСрТ рТрАрА 5'

ДНК полимераза 1 (но ие фрагмент Кленова) широко и_.поль зуется для получения меченых ДНК методом так называемой ник-трансляции (от англ. nick, обозначающего «одноцепочечный разрыв»). Если одна нз цепей ДНК содержит одноцепочечный разрыв так, что 3 концевой нуклеотид в месте разрыва имеет З'-ОН-группу, то ДНК-полимераза 1 в присутствии четырех нук-леозндтрифосфатов осуществляет матричный синтез. Одновременно она гидролизует существовавшую цепь за счет 5' 3'-экзонуклеазной активности, как показано на схеме:

ОН

5_3 ¦ ДНК - полимераза I ,., ¦ АДДДА/J —¦___j__il .. WAV 3'

3'i вц— ±-1 4с^ТР ' ~~ ¦¦ 5'

По мере синтеза удлиняется 5'-концевой фрагмент и укорачивается З'-концевой фрагмент. В результате З'-концевой фрагмент может быть полностью замещен вновь синтезированной ДНК. Если для кик-трансляции использоаать меченые трифосфаты, то синтезированная ДНК получается меченой.

ДНК-полимераза бактериофага Т4 получается из клеток Е. coli, инфицированных бактериофагом Т4. Фермент обладает ДНК-по-лимеразной и значительно более высокой по сравнению с ДНК-по-лимеразой I 3' —»¦ 5'-экзонуклеазной активностью, но, в отличие от последней, не проявляет 5' -*- З'-экзонуклеазную активность.

ДНК-полимераза Т4 может быть использована в основном так же, как ДНК-полимераза I. Сильная 3' -*¦ 5'-экзонуклеазная активность позволяет применять фермент для введения метки в ДНК без выступающих концов и с З'-аыступающими концами.

К двухцепочечному полинуклеотиду добавляют ДНК-полиме-разу и один меченый dNTP. Фермент за счет У —*¦ 5'-экзонуклеазной активности удаляет нуклеотиды с З'-конца каждой из цепей вплоть до нуклеотида, который содержит то же гетероциклическое основание, что и добавленный в смесь dNTP. За удалением этого звена следует его восстановление за счет полимеразной активности фермента. Таким образом, устанавливается псевдоравновесие: происходит постоянное отщепление и включение З'-концевого эвена. При каждом акте включения используется молекула dNTP, при отщеплении удаляется 5'-нуклеозидмонофосфат. Результатом реакции является превращение три фосфата а монофосфат. Реакция идет до тех пор, пока не израсходуется весь иуклеоэидтрифосфат. После этого начинается экзонуклеазное расщепление, которое может привести к полному гидролизу ДНК.

Особое значение имеет фермент РНК зависимей ДНК-полимераза (обратная транскриптаза) (открыта Г. Теминым и независимо Д. Балтимором), источником которой обычно служит вирус миело-бластоза птиц. Фермент, подобно ДНК зависимым ДНК-полиме-разам, осуществляет зависимую от затравки и матрицы полимеризацию дезоксинуклеозидтрифосфатов, синтезируя ДНК, комплементарную матрице. Затравкой служат дезоксирибо- или рибоиуклеотиды, однако в качестве матрицы, наряду с одно цепочечной ДНК, фермент может использовать и одноцепочечную РНК. Фермент обладает также активностью рибонуклеазы и способен деградировать РНК в гибридном комплексе ДНК ¦ РНК. Деградация происходит по экзо нуклеаз ном у типу как с 3'-, так и с 5'-концов РНК.

Обратные транскриптазы наиболее щироко используются в генной инженерии для получения ДНК, комплементарных матричным РНК.

Важнейшим классом являются также ДНК-зависимые РНК-полимера зы. Эти ферменты катализируют синтез РНК, комплементарных ДНК-матрицам (транскрипцию), используя в качестве субстратоа рибонуклеозидтрифосфаты. Общая схема синтеза такая же, как и у ДНК-полимераз, однако РНК-полимеразы способны начинать синтез без затравки, т. е. инициировать синтез РНК. Сигнал инициации синтеза заключен в специальных регу-яторных последовательностях ДНК, называемых промоторами. (Более подробно о транскрипции см. с. 411).

Существует также большое число ферментов, аналогичных полимеразам, но способных к безматричному синтезу полинуклеотидов. Из них наибольшее применение нашла концевая дезокси-нуклеотидилтра нефе раза (терминальная трансфераза). Концевая нуклеотидилтрансфераза (из тимуса теленка) осуществляет последовательное присоединение нуклеотидных звеньев к З'-ОН-кон-цевым группам ДНК. Субстратами служат дезоксирибонуклео-

351

Синтез нуклеиновых кислот

Балтимор (Baltimore) Дмид (р 1936), американский вирусолог. Образование получил в Массачусетском технологическом институте в Кембридже и Рокфеллеровском институте; с 1968 г.-— профессор Центра онкологических исследований Массачусетского о н ко -логического института. Основные работы —- по расшифровке механизма биосинтеза белка. Изучал влияние он когенных вирусов на генетический аппарат клетки. Открыл (1970, независимо от Г. Темина) явление обратной транскрипции, обнаружив в вирусе фермент-обратную транскриптазу. Лауреат Нобелевской премии по физиологии и медицине (1975, совместно с Р. Дульбекко и Г. Теминым).

352 зидтрифосфаты. В присутствии ионов Mg*+ фермент преиму-

щественно использует в качестве затравки одноцепочечные или

Нуклеиновые кислоты двухцепочечные ДНК с З'-выступающими концами (последние мо-

гут быть получены из полностью двухцепочечных ДНК с помощью экзонуклеазы фага к). Однако в присутствии ионов Со*'+ присоединение идет по любым З'-ОН-концевым группам ДНК:

Мп для оДноцвпачечны-

n dNTP +¦ ДНК — ОН -*—--—--_ flHK-p(dN)n+ppi

Со' для двухцепочечных

В результате к З'-ОН-группам ДНК присоединяется полидезокси-рибонуклеотидная одноцепочечная последовательность, состав которой зависит от состава смеси дезоксирибонуклеозидтригрос-фатов, использоааниых в реакции. Если имеется один единственный трифосфат, то синтезируется гомополимер — поли • (dA), поли-(йТ). поли-CdG) или пoли•(dC).

Фермент используется в генной инженерии при клонировании фрагментов ДНК (см. с. 433) и в анализе последовательности ДНК для введения метки по З'-коицевым звеньям.

ДНК- и РНК-лигазы. Существуют ферменты способные соединять между собой фосфодиэфирной связью целые фрагменты ДНК или РНК. Такие ферменты называются лигазами. Из многочисленного семейства лигаз наибольшее применение получили ДНК- и РНК-лигазы, синтезирующиеся в клетках, инфицированных бактериофагом Т4. Так, Т4 ДНК-лигаза катализирует образование сросфодиэфирной связи между З'-ОН- и 5'-РО<-группами а одноцепочечных разрывах двухцепочечных ДНК (схема а) или между такими же группами двухцепочечных молекул ДНК, содержащих на концах комплементарные одпоцепочечные последователь ности (схема б).

О АА Т ТС С Т Т A A G

II

III G А А Т Т С 1 С Т Т А А 6 1

-1 ¦ р он

НО р 1 1

III G А А Т Т С 1 С Т Т A A G 1 -1 1- Р о и

Т4 ДНК-лига..

G A AT ТС С Т ТА A G

Такими комплементарными последовательностями могут быть, в частности, одноцепочечные участки, образующиеся при расщеплении ДНК какой-либо рестриктазой. На схеме б представлен пример образования «липких» концов при расщеплении ДНК рестриктазой EcoRI. Со значительно меньшей скоростью, но все же достаточно эффективно фермент соединяет между собой полностью двуспиральные фрагменты ДНК с З'-ОН- и 5'-Р04-груп-пами (схема в)

Фермент использует а качестве кофактора АТР и требует для работы присутствия в среде ионов Mg' + .

ДНК-лигаза широко используется в генной инженерии для соединения фрагментов ДНК и при химико-ферментативном синтезе ДНК.

РНК-лигаза катализирует ковалентиое связывание одиоце-почечиых ДНК или РНК, при условии, что они содержат концевые З'-ОН- и 5'-Р04-группы. Молекулы, содержащие З'-ОН-группы, принято называть акцепторными, а 5'~РОА—до норны ми. В роли доноров выступают олиго нуклеотиды и двухцепочечные ДНК. Минимальными донорами могут быть нуклеозид 3',5'-дифос-фаты pNp и pdNp. Поли рибоиуклеотиды более эффективны в качестве акцепторов, чем полидезоксирибонуклеотиды. Трииуклеозид-дифосфаты NpNpN — ОН являются минимальными акцепторами. Эта реакция ли ирования иллюстрируется схемой.

РНК-лигазу широко используют для введения метки в З'-кон-цевые звенья РНК. В качестве доноров служат 5'-32Р-меченые 3',5'-нуклеозиддифосфаты. Фермент находит применение в химико-ферментативном синтезе полирибонуклеотидов. Добавление его к ДНК лигазе значительно ускоряет реакцию «сшивания» двухцепочечных молекул ДНК.

Следует упомянуть также ферменты, которые присоединяют фосфатные группы к ДНК и РНК, — так называемые полинук-леотидкиназы. Для включения метки в 5'-концы ДНК (или в синтетические олигонуклеотиды) широко применяется полинуклеотид-киназа бактериофага Т4. Основная реакция, катализируемая ферментом, заключается в переносе У"Ф°сФатнои группы АТР на 5'-ОН-группу олиго- и полинуклеотидов. Фосфорилируются как рибо-, так и деэоксирибопроизводные Скорость фосфорилирования двухцепочечных молекул несколько ниже, чем одноцепочечиых

В результате реакции АТР превращается a ADP. Киназа осуществляет также обмен 5'-концевых фосфатных групп олиго- или полинуклеотидов с у-фосфатной группой АТР в присутствии избытка ADP. Фермент используют для введения меченых фосфатных групп в 5'-концевые звенья ДНК. Для этого применяют АТР, содержащий радиоактивный атом фосфора (,J Р) в у-положении: 3!РРРА.

Т4 полинуклеотидки аза широко используется для фосфорилирования олиго- и полинуклеотидов при работе с рекомбинант-ными ДНК, при химико-ферментативном синтезе нуклеиновых кислот и определении их последовательности.

353

Синтез нуклеиновых кислот

S' ...pApTpG 3' 5рСрТрА 3', Мд2+ АТР

5' ...pApTpGpCpTpA 3' -.

..

страница 47
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(26.07.2017)