Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

)-эндо]. Транс-конформация этой связи приводит к увеличению длины нуклеотиднои единицы по сравнению с g^-конформацией.

ДНК способна переходить из А-формы в В-форму и обратно в зависимости от природы растворителя. Не исключено, что такие переходы имеют место и при взаимодействии с белками.

Долгое время считалось, что ДНК может быть только право-вращаюшей и левоврвщающая спираль стереохимически невозможна. Однвко недавно было доказано, что левоврвщающая спираль существует. Она былв ивйденв в случве двуспиральных альтернирующих сополимеров: поли (d(G—С) ] - поли [d (G—С) ] и поли (d(G — T)l -поли[d(С — A)J (рис. 195). Необычное свойство ле-Рис. 195. ДНК в z-форме. вых спиралей состоит в том, что повторяющейся единицей в них

является не мононуклеотид, а дннуклеотид, поскольку каждые два соседних нуклеотида находятся в различных конформациях Например, в одной нз левовращающих форм первое нуклеотидное звено имеет конформацию g g+g+ttg+s, характеризующуюся сын-положением пурина н С(3')-эмдо-конформацией углевода; второе звено имеет анты-положение пиримидина и С (2') -эндо-конфор-мацию углевода и характеризуется формулой g g g~tgfta. Таким образом, общая формула повторяющейся динуклеотидной единицы (g g g ttg stg g g (g ia) Такая спираль с характерным зигзагообразным строением получила название Z-формы. Получены данные, что Z форма может существовать и в растворе.

Какие же силы способствуют образованию и сохранению дву-спиральных структур? Долгое время считалось, что это — возникающие между цепями водородные связи. Однако сейчас стало ясно, что основной вклад в стабильность двуспиральных молекул вносят другие силы, прежде всего взаимодействия между плоскостями оснований в стопках, т. е. «стэкинг»-взанмодействия; существенную роль играют также взаимодействия между ДНК и водой, в результате которых ДНК стремится принять максимально компактную структуру для уменьшения поверхности соприкосновения с водой. При этом гидрофобные основания локализуются внутри спирали, а на ее поверхности образуется гидратируемая угле водно-фосфатная оболочка.

Дестабилизирующее воздействие оказывают силы электростатического отталкивания между отрицательно заряженными фосфатами комплементарных цепей.

Циклические ДНК и суперспирализации. Многие двухцепочеч-ные ДНК в природе являются циклическими: плазмиды, ДНК митохондрий и хлоропластов, ДНК многих вирусов и бактерий. Такие ДНК, как правило, существуют в суперспиральном состоянии. При этом двойная спираль закручивается сама на себя, как показано на рисунке 196, количество витков образующейся суперспирали зависит от внешних условий. Суперспиралиэация циклических ДНК приводит к сильному изменению физических свойств молекулы в особенности гидродинамических и электрофоретических. В клетках суперспиралнзацня осуществляется особыми грерментами, которые для бактерий сравнительно хорошо изучены и называются ДНК-гнразами (или топоизомеразами II). Другие ферменты — топоизомеразы I — могут уменьшать число супервитков в кольцевых молекулах, давая набор «изомеров» с различным числом вн ков

Знак суперспирали определяется по взаимодействию ДНК с определенными химическими веществами, способными связываться с ней и раскручивать двойную спираль. Такими веществами являются, например, ннтеркалирующие красители. Наиболее часто для этих целей используется этиднйбромнд; степень раскручивания увеличивается с концентрацией красителя

341

Строение нуклеиновых кислот

Рис. [46. Суперспираличация ли хцеп чечннй ДНК пол действием ДНК-гиразы: (а) релаксированная форма; (fi) — суперспнралнзованная форма.

Зтидиибромид

342

Нуклеиновые кислоты

Рнч (Rich) Александр (р. 1924), американский ученый, работающий в области молекулярной биологии и Биофизики. Образование получил в Гарвардском колледже и Гарвардской медицинской школе, с 1974 г-— профессор Массачусетского технологического института в Кембридже. Один из ведущих специалистов в области нуклеиновых кислот.

Суперспиральная ДНК при центрифугировании осаждается быстрее, чем релаксированная форма, т. е. лишенная суперспиральных витков. Если проводить центрифугирование а присутствии этидннбромида и определять зависимость скорости седиментации циклической ковалентно замкнутой ДНК от ее концентрации, то можно определить знак суперспирали.

При супе реп и рал и за цин ДНК приобретает «скрытую» конфор-мационную энергию, влияющую на любой процесс, происходящий с изменением числа виткоа двойной спирали. Благодаря этому некоторые ферменты, вызывающие локальное расплетание ДНК (например, РНК-полимеразы, см. ниже), связываются с отрицательна суперспнралнзованной ДНК более эффективно. Другим следствием супере пира л изаини является реальная возможность образования участков вторичной структуры, которые термодинамически невыгодны и практически не существуют в линейной илн релакенрован-ной циклической ДНК.

Разрушение и восстановление двуспиральных структур. Денатурация, ренатурация, и гибридизация. Двуспиральиые структуры очень стабильны в физиологических условиях при значениях рН, близких к нейтральным, температурах около 30 — 40 °С и в присутствии 0,15 моля соли. Однако увеличение или уменьшение рН, повышение температуры и добавление в среду некоторых веществ, таких, например, как мочевина, приводит к разрушению даух-цепочечной структуры, предельным случаем которого является денатурация, т. е. полное разделение отдельных нитей.

Температура, при которой доли спирального и неспнрального состояний равны, называется температурой плавления и обозначается Тт. Для каждой ДНК в постоянных условиях Тт постоянна и характеризует стабильность двуспиральной структуры. Другой характеристикой ДНК является ширина температурного перехода \Т , которая отражает кооперативность переходе. Если бы все звенья разрушались одновременно, то \Т была бы равна нулю. Однако процесс плавления идет через ряд промежуточных состояний, н поэтому \Т,„ имеет конечное значение.

Ширина интервала плавления для даухцепочечных синтетических полинуклеотидов, таких, как поли(<ЗА) -поли(с)Т), значительно уже, чем у природных ДНК, что является следствием гетерогенности последних. Температура плавления ДНК линейно возрастает с увеличением доли G-C пар. На этом основан один из методов определения нуклеотидного состава ДНК.

Разрушенная двуспиральная структура в определенных условиях может быть восстановлена, по крайней мере частично. Этот процесс называют ренату рацией. Ренатурация происходит, если раствор денатурированной ДНК выдерживать определенное время в условиях, когда двуспиральная структура стабильна. Скорость ренатурацин зависит от многих факторов, н в первую очередь от так называемой сложности ДНК, которая представляет собой число нуклеотидных пар в неповторяющихся последовательностях ДНК. Для ДНК вирусов и бактерий сложность ДНК равна числу нуклеотидных пар в геноме, поскольку в этом случае ДНК не содержит повторяющихся последовательностей достаточно большой длины. Чем выше сложность ДНК, тем медленнее идет ренатурация. Если ренатурацни подвергают не целые, а фрагментированные молекулы, то скорость ренатурацин возрастает с увеличением длины фрагментов.

Ренатурация широко применяется для исследования структуры ДНК. В частности, она используется для изучения сходства и различий разнородных ДНК. Две ДНК из разных источников дена турируют и затем смесь нх ренатурнруют. При этом, наряду с исходными нативнымн молекулами, образуются гибридные молекулы,

содержащие цепи из различных ДНК. Исследование таких гибри- 343

дов под электронным микроскопом позволяет определить в них по- -

ложение одно- и двухцепочечных участков. Двухцепочечные уча- Строение нуклеиновых кислот стки образуются в областях гомологии исследуемых ДНК. Рена-турацня в этом случае называется гибридизацией.

Конформации одноцепочечных нуклеиновых кислот. Многие нуклеиновые кислоты — большинство РНК и ряд ДНК — существуют в од но цепочечной форме. Тем не менее они принимают в растворах и кристаллическом состоянии (в тех случаях, когда удается их закристаллизовать) конформации, в которых двухцепочечные участки чередуются с одноцепочечными. Наиболее хорошо изученными одноцепочечными поли нуклеотида ми являются тРНК.

Конформация тРНК. Транспортные РНК выполняют в клетках разнообразные функции. Однако основная их задача заключается в осуществлении трансляции. В 1965 г. Р. Холли установил первичную структуру тРНКА1в из дрожжей. Тогда же, исходя из представления, что наиболее стабильное состояние тРНК соответствует образованию максимально возможного количества во дородно-связанных пар оснований, а также основываясь на экспериментальных данных по неравномерному гидролизу молекулы рибоиуклеазами, Р. Холли предложил модель вторичной структуры тРНК необычной формы — с чередующимися одно- и двух цепочечными участками — н назвал эту структуру «клеверным листом» (рис. 197).

Рис. 197. Структура «кленерн листа» тРНК.

344

Нуклеиновые кислоты

Клуг [Klugl Аарон (р. 1926), английский кристаллограф. Образование получил ¦ университете Витвотерсрэнда в Йоханнесбурге и Кейптаунском университете (ЮАР), с 1962 г. работает а лаборатории молекулярной биологии Медицинского исследовательского совета в Кембридже. Известен работами по изучению нуклеопротеидов методом рен гено тру к урного анализа. Лауреат Нобелевской премии по химии (1982)

С тех пор были определены последовательности более 100 тРНК из разных источников, и оказалось, что, несмотря на значительные различия первичных структур, все тРНК имеют сходную вторичную структуру типа «клеверного листа». Эта структура характеризуется пятью ответвлениями («лепестками»), в составе которых имеется одноцепочечный участок и двухцепочечный стебель. Каждому ответвлению присвоено свое название либо по структурному, либо по функциональному признаку: участок, включающий З'-конце вое звено тРНК, к которому присоединяется аминокислота, получил название аминоацильного (АА); содержащий в петле анти-кодон — антикодонового (АС); участок, в петле которого содержится общая для всех тРНК последовательность ТфС — Т-участка; участок, содержащий дигндроуридины,— D-участка. Наконец, фрагмент структуры, расположенный между Т- и АС-ответвлениями, имеет для всех тРНК различные размеры н называется вариабель ным V-участком.

Структура типа «клеверный лист» объясняла характерную реакционную способность нуклеотидных звеньев в разных участках тРНК по отношению к химическим агентам и к действию рибо нуклеаз. Однако гидродинамические характеристики молекулы свидетельствовали о ее более компактной упаковке, которая могла бы осуществляться за счет третичной структуры. Способ образования третичной структуры стал ясен после ре нтге но структурно го анализа первой тРНК, которую удалось получить в кристаллическом состоянии (тРНКР|,е из дрожжей). Рентгенеструктурные исследования были выполнены одновременно двумя группами — в лабораториях А. Рича (США) и А. Клуга (Великобритания). Впоследствии были установлены третичные структуры еще нескольких тРНК. Третичная структура молекулы тРНКр"е изображена на рисунке 198, она напоминает латинскую букву L.

Общие закономерности, найденные для структуры тРНК, по-виднмому, реализуются и в других одноцепочечных полннуклеоти-дах. Те из них, для которых уже определены первичные структуры, могут быть представлены как образования с чередующимися двух- и од но цепочечными участками. Например, молекулы рибо сомных 5S РНК имеют вторичные структуры, сходные с «клеверным листом» тРНК. Значительно более сложно выглядят структуры высокомолекулярных рибосомных или вирусных РНК (рис. 199). Несомненно, что такие РНК находятся в компактной форме, как это следует нз их гидродинамических свойств, однако детали пространственной организации пока неизвестны.

Так же как и двухцепочечные полннуклеотиды, одноцепочечные молекулы могут денатурировать с разрушением вторичной и третичной структур. Денатурация наблюдается при повышении температуры, понижении ионной силы или добавлении в среду денатурирующих агентов — мочевины, органических растворителей и т. д.

Изучение плавления РНК различными методами (УФ КД и ЯМР-спектроскопия) позволяет сделать вывод о многостадийном характере этого процесса. Кооперативность процесса плавления одноцепочечных молекул значительно меньше, чем в случае дву-спиральных.

До енх пор рассматривались статические структуры ДНК и РНК, которые представляют собой среднее и наиболее вероятное состояние молекулы в данных конкретных условиях. Важно тем не менее понимать, что даже при низких температурах, далеких от температуры плавления, полинуклеотндная цепь находится в постоянном данжении, определяемом тепловыми колебаниями. Нуклеотидные звенья сохраняют достаточную степень свободы и совершают локальные движения, значительные по амплитуде н частоте.

346

Нуклеиновые кислоты

Рис. 199. Участок вторичной структуры РНК фага MS2.

Вероятно, в основе их лежит конформационная гибкость фураноз-ного цикла нуклеотиднои единицы, способной к переходу от С{2')-эндо- к С(3')-эндо-конформации, н наоборот. Подобные переходы, в свою очередь, сказываются на торсионных углах фосфодиэфирных и N-гликозидных связей и приводят к таким эфгректам, как изменение перед плавлением и «дыхание» поли нуклеотида.

О динамичности структуры полинуклеотидов свидетельствует ряд данных, полученных химическими методами. В частности существование равновесия во дородно связанной и свободной форм оснований следует из результатов экспериментов по тритиевому или- дейтерообмену. Другая группа данных, которая также позволяет предположить динамические нарушения вторичной структуры ДНК, основана на изучении ее взаимодействия с так называемыми интеркалирующими веществами. Эти соединения имеют плоские ароматические хромофоры, как, например, этидийбромид (см. с. 341).

Рентгеноструктурный анализ комплексов таких соединений с синтетическими двух цепочечными олигонуклеотидами показывает, что плоские ароматические кольца красителей внедряются между парами оснований двойных спиралей. Механизм внедрения предполагает проникновение молекулы красителя между парами оснований в момент возникновения локального нарушения структуры, при этом водородные связи между парами оснований сохраняются, тогда как стэкинг взаимодействия нарушаются.

Одним из вариантов такого нарушения структуры является образование так называемых «кинков», представляющих собой из

ос ,G.

?¦? ь..ь. a c.j, Аз >. 3

SB м я ел Д^4-В //

gauagagcccucaacc acucgucguuccguc g ac с C-G ' Cp-O*"

4:

V77777777777. . >- c-> co 60

.eUGAGCGGCAAGGCGGyA* О .О G-c A , (f ,Ъ •

ft fi У ' /Л U

ccccaagcaacuucgAcgggguccugaaugg g cu UAUY?U *

A CAACAGAAGCUpO|cc?AGGACUUAC с q Gl 1 GUAACgg

U ^ C-G С

u ¦ a

r.-a - u

*uug aucuuccucgcgaucuuucucucgaaa u u u а сcaa ucaau ссuucuguc

ломы двойной спирали, схематически изображенные на рисунке 200. 347 Впервые гипотеза о возможности «кии ков» была высказана Ф. Крн- — ком и А. Клугом для объяснения способа укладки ДНК в нуклео- Строение нуклеиновых кислот сомах х

страница 46
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(26.09.2017)