Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

, при помощи РНаз). Пример определения последовательности рибо олигонуклеотида таким методом изображен на рисунке 177.

Неполные расщепления используются и в случае установления последоаательности ДНК. Для этой цели может быть применена обработка как рестрикционными эндонуклеазами, так и неспецифичными эндонуклеазами (например, ДНазой I в присутствии ионов Мп5+).

Определение строения .олигонуклеотидов. Во всех современных способах определения первичной структуры нуклеиновых кислот первостепенную роль играют методы введения радиоактивных меток в 5'- и З'-концевые звенья. Чаще всего роль концевой метки играет фосфатная группа, содержащая 32Р, но иногда в качестве метки используют также тритий (3Н) или нод (1251).

Для введения меченых фосфатных групп в-5'-концевые звенья олиго- и полинуклеотидов используется фермент полинуклеотидки-наза (см. с. 353); радиоактивным реагентом служит АТР, содержащий меченый фосфор в у-положении (' рррА)

Методы включения метки в З'-концевые группы более разнообразны. Так, а вухцепочечные ДНК метка вводится в составе [а-Э2Р1-дез-окс и рибонуклеознд три фосфатов с помощью ДНК-полимеразы I Е. coli или фага Т4 (см. с. 348). Двух- и одноцепочечные ДНК могут быть помечены по 3 концевому звену с использованием концевой ну к леотидил трансферазы. В одном из вариантов этого метода к З'-ОН-группе олигодезокси рибо нуклеотида присоединяются [a-1JP]-меченые рибонуклеозидтрифосфаты. После ферментативной реакции продукт подвергается щелочному гидролизу, в результате чего на З'-конце образуется только одно рибонуклеотидное звено. Во втором способе используются аналоги природных нук-

легаидтрифосфатов, не содержащие З'-ОН-группы. Такие аналоги 317 могут быть введены в З'-концевое звено олигонуклеотида, но ие — способны присоединять к себе последующие звенья, поэтому их Строение нуклеиновых кислот называют терминирующими. Обычно для этих целей применяются кордицепинтрифосфат или 2 ,3 дидеюксииуклеоэидтрнфосфаты содержащие [а-3"Р1-меченую фосфатную группу:

Введение в З'-концевое звено РНК 3',5'-дифосфатов, меченных Э!Р по 5'-фосфатной группе, может быть осуществлено с помощью РНК лигазы, присоединяющей субстрат к З'-ОН-группе. З'-Конец РНК может быть маркирован также тритием с помощью химических методов: окислением периодатом и восстановлением бортри-тидом натрия. При этом используется РНК, не содержащая З'-фос-фатной группы.

Необходимым составным элементом анализа нуклеотидной последовательности во многих случаях является определение кон-

О

ч!

о

ni

N

о

о

Фосфо д и ас те ра за из змеиного ядл

it

о-

\

он

"О—Р

IN о

-о—Р

|\1

о

N о

ОН 1|

о

\

ОН

в, в в, в.

о

о-

о

о41

N

о-

о

н

IM

он

ДН.л П +

Фосфодиэстер.зв селезенки

он

о

NLo-

SJo-

но

м

о

К"

р-

но

о

Ml

р—о-

I

о

•"р —О"

он

но

\

цевых групп. Это достигается введением метки (5'- или 3'-1 1 -фосфата) в 5'- и З'-концевые звенья олиго- или полинуклеотидов с последующим ферментативным гидролизом до соответствующих нуклеозидмонофосфатов. После разделения продуктов гидролиза идентифицируются меченые концевые звенья.

Для определения первичной структуры коротких олигонуклеотидов (до 15 — 20 звеньев) обычно используют метод «блуждающего пятна», или «сэнгерпринта». Меченный по одному из концов олиго-нуклеотид гидролизуется экзонуклеазой с противоположного конца в условиях неполного расщепления, так что образуется набор всех возможных фрагментов. При расположении полученных таким путем олигонуклеотидов в порядке возрастания длины каждые два соседних продукта будут отличаться друг от друга на одно концевое звено. Меченое же звено у всех олигонуклеотидов является общим (рис. [78).

Совершенно очевидно, что если разделить все полученные олигонуклеотиды и для каждого из них определить концевое звено, противоположное меченому, то после расположения всех фрагментов в порядке возрастания длины можно реконструировать последовательность исходного олигонуклеотида. Таким образом, проблема заключается в разделении продуктов и идентификации их концевых групп.

В методе «блуждающего пятна» эти две задачи решаются одновременно. Смесь меченых фрагментов подвергается двумерному разделению. Сначала оно проводится путем электрофореза на полосках ацетата целлюлозы при рН 3,5 (разделение по составу), а затем влажная полоска прикладывается к краю пластинки с ДЭАЭ целлюлозой, которая сорбирует частично разделенные олигонуклеотиды, и разделение ведется в направлении, перпендикулярном первому (разделение по длине). В качестве элюента используется гидролизат РНК, содержащий олигонуклеотиды всех возможных длин и составов (такая процедура называется гомохроматографией).

Ре1ультат ращстения фиксируется радиоавтографиеи: для этого к пластик? прикладывается ренпенсвская пленка, и те участки, которые контактируют с радио- - _

активными продуктами, шскечиваются. В ре!ультате каждому фра!менту соответ-

TBUt*X I1T Hp rih.ll.nf> П «ТИП КЯ ППРиЬР Ы г1~|Я VTI4U.»f hU SUBHIIUmUPTi а 11Т11Л1 UTPnLlinp ПЧ1 ГТ1Л-

ствует отдельное пятно на пленке и фактически anain чируется относительное расположение полученных пятен.

Если сравнивать подвижность каждого олигонуклеотида при электрофорезе с подвижностью получаемого из него продукта, укороченного на одно звено, то наблюдаются следующие закономерности: отщепление рТ приводит к уменьшению подвижности продукта по сравнению с исходным олигонуклеотидом вследствие резкого уменьшения заряда. Отщепление pG вызывает качественно такой же, но количественно меньший эффект. Отщепление рА, уменьшая длину олигонуклеотида и в значительно меньшей степени (по сравнению с рТ и pG) заряд, приводит к некоторому увеличению подвижности. Наконец, отщепление рС очень мало меняет заряд, но резко уменьшает длину, что существенно увеличивает подвижность продукта.

При гомохроматографии разделение происходит в соответствии со следующими закономерностями: чем больше длина олигонуклеотида, тем он менее подвижен, так что каждые два соседних пятна представляют собой олиго нуклеотиды, отличающиеся на одно звено; если два соседних пятна получены в результате отщепления пуринового нуклеотида, то расстояние между ними по вертикали больше, чем при отщеплении пиримидинового нуклеотида.

В качестве примера рассмотрим анализ радиоавтограммы, приведенной на рисунке 174. Очевидно, что наименее подвижный при гомохроматографии компонент представляет собой исходный олигонуклеотид. Соседний с ним продукт образуется путем отщепления З'-кснцевсго звена: при электрофорезе подвижность его слегка увеличивается, а при гомохроматографии — резко возрастает. Отсюда делается вывод, что отщепленным звеном является А. Следующий продукт (3) отличается от продукта (2) также одним звеном. Он значительно менее подвижен при электрофорезе и несколько более подвижен при гомохроматографии. следовательно, (3) образуется из (2) в результате отщепления Т. Продолжая такой анализ, определяют звено, которым отличается друг от друга каждая пара соседних пятен, т. е. концевые звенья каждого олигонуклеотида смеси. «Читая» эти концевые нуклеотиды, можно восстановить исходную последовательность.

Используемые в методе «блуждающего пятна» правила схематически представлены в рамке на рисунке 179.

Отщепление Т резко уменьшает подвижность при электрофорезе и мало увеличивает при гомохроматографии.

Отщепление G незначительно уменьшает подвижность при электрофорезе и сильно увеличивает при гомохромато. рафии

Отшепление А незначительно увеличивает подвижность при электрофорезе и сильно — при гомохроматографии.

Отщепление С сильно увеличивает подвижность при электрофорезе и незначительно — при гомохроматографии.

С помощью метода «блуждающего пятна» могут определяться последовательности олиго нуклеотидов, содержащих до 20 звеньев. Одним из наиболее существенных его недостатков является недостоверность определения последовательности двух или трех звеньев, соседних с меченым звеном.

Соаременные методы определения последовательности фрагментов нуклеиновых кислот осноааны на одном общем принципе. Этот принцип заключается в сравнении длин всех возможных концевых продуктов, полученных из исходного полимера таким образом, что все они имеют на одном конце одну и ту же последовательность, а на другом — один и тот же нуклеотид.

320 В таблице 12 представлены наборы концевых продуктов разной

--длины, имеющих одно и то же 5'-кониевое звено (G), а оканчиваю

Нуклеиновые кислоты щихся аденозином (колонка А), гуанозином (колонка G), цитиди-

ном (колонка С) или тимидином (колонка Т). В колонке А находятся пента нуклеотид, ундека- и тридек а нуклеотид, длины которых совпадают с положением А в исходном полинуклеотиде. Аналогично в колонке С длины фрагментов (три-, гекса-, нона-, дека-, тетрадека-и пентадека-) соответствуют положению С в исходном нуклеотиде. То же справедливо для соединений, оканчивающихся G и Т.

Следовательно, если для полинуклеотида получить полный набор концевых продуктов, специфически «оборванных» у определенного типа звеньев, та из анализа их длины легко определить положение данного звена в исходном полинуклеотиде. Проводя подобную операцию для каждого из четырех нуклеотидных звеньев, можно вывести полную последовательность исследуемого полимера.

Однако определение абсолютных длин фрагментов — операция весьма затруднительная, и поэтому современные методы анализа заменяют его сравнением длин продуктов, оканчивающихся разными типами звеньев. Если нуклеотиды (табл. 12) записывать в последовательности увеличения их длины на одно звено начиная Рис. 179. Двумерное разделение смеси с самого короткого продукта (колонка G, затем колонки Т, С. снова радиоактивных нуклеотидов. Т, А и т. д.), то получается грормула GTCTACGGCCATACC, соот-

Элентрофорез нааие'*ге целли>-*)>>- рН 3,5

ветствующая последовательности исходного олигонуклеотида. При 321

таком рассмотрении учитываются не абсолютные значения длин -¦-—

олиго нуклеотидов, сравнение ведется по принципу «короче — Строение нуклеиновых кислот длиннее».

Таким образом, для полного анализа последовательности любого полинуклеотида необходимо иметь, во-первых, метод получения четырех наборов специфических концевых продуктов, подобных тем, которые приведены втаблице 12, и, во-вторых, метод, позволяющий проводить сравнение длин этих продуктов. Различие современных методов анализа заключается в способах получения наборов специфических фрагментов. Общность — в способе сравнения длин, которое во всех случаях производится путем электрофореза радиоактивных концевых продуктов в пластинках полнакриламидного геля. По окончании электрофореза положение продуктов в геле определяют путем радиоавтографии. Каждый продукт проявляется в виде темной полосы на рентгеновской пленке; сравниваются относительные подвижности полос в разных дорожках, подобно тому как сравнивались длины продуктов в таблице 11 Картина распределения полос на рисунке 180 соответствует последовательности олигоиуклеотидов в таблице 12. Это следует из анализа относительных подвижностей продуктов: самый подвижный и, следовательно, самый короткий продукт обнаруживается в дорожке G, следующий по подвижности и длине — в колонке Т. далее — в колонке С, следующие два — в колонках Т и А соответственно и т. д. Выписывая таким образом названия колонок в порядке, в котором в них обнаруживаются последовательно удлиняющиеся продукты, получают формулу исходного олигонуклеотида.

Метод неполных специфических химических расщеплений (метод М а к с а м а — Гилберта) используется для определения последовательности ДНК. Меченые концевые продукты получают путем специфического расщепления полинуклеотида химическими реагентами по одному из звеньев. Обработка проводится в услоаиях неполной «статистиче-

Таблица 12,

Схема определения последовательности лолннуклеотидов 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

5'pGTCTACGGCC А Т А С СЗ'

Длина Концевые продукты, заканчивающиеся эвеном Последовательность,

концевого

выведенная

продукта А G С T из анализа

1 рС, 5' G

2 pGT Т

3 рСТС С

4 pGTCT Т

S pGTCTA А

е рСТСТАС С

7 pGTCTACG G

8 pGTCTACGC G

9 pGTCTACGGC С

10 pGTCTACGGCC С

11 pGTCTACGGCCA А

12 pGTCTACGGCCAT Т

13 pGTCTACGGGCATA А

14 pGTCTACGGCCATAC С

15 pGTCTACGGCCATACC С 3'

322

Нуклеиновые кислоты

A G С Т

Рис. 180. Схематическое изображение результатов разделений в шллиакрил амидном геле 4 серий концевых продуктов, представленных в таблице 12.

скои» модификации. В результате получается большой набор различных продуктов, но только концевые олиго- и полинуклеотиды являются мечеными и обнаруживаются на радиоавто граммах. Так, например, при частичном расщеплении по тимидиновым звеньям (а положениях, указанных стрелками) меченного по 5'-концу олигонуклеотида 3ipG — Т — р — С — р — Т — р — А — С могут образоваться следующие олигонуклеотиды: "^pGpT, 32pGpTpCpT, рСрТрАрС, рАрС, рСрТ, из которых мечеными оказываются только два концевых. Для специфических расщеплений используются реакции, приводящие к удалению гетероциклического основания из полинуклеотидной цепи. После этого цепь может быть расщеплена по образующемуся дезоксирибозильному звену или его производному путем -элиминирования действием щелочи или аминов.

Далее рассматриваются четыре реакции, используемые в одном из вариантов метода. В качестве объекта выбран олиго нуклеотид, приведенный в таблице 12.

А. Расщепление ДНК по гуаиозиновым звеньям осуществляется неполной модификацией ДНК д и метиле ульфатом. Метилирование затрагивает атом азота в положении (7) в G. а также N(1) и N(3) положения в А. Продукт неполной модификации обрабатывается пиперидином при повышенной температуре. При этом N-гликозид-ная связь разрывается и поли нуклеотид на я цепь подвергается фрагментации с образованием продуктов, содержащих на 5'- и З'-концах фосфатные группы (рис. 181).

В этих условиях не происходит расщепления полинуклеотидной цепи по метилированным производным аденозина. Из модельного нуклеотида в результате реакции должны получиться следующие меченые олигонуклеотиды, образовавшиеся при расщеплении по G:

'-'Р, d(J'pG~T-C-T-A-Cp) и d(3*pG-T-C-T-A-C-Gp)

Эти фрагменты отличаются от продуктов, приведенных в колонке G таблицы 12, лишь тем, что на месте гуаниновых остатков содержатся только фосфатные группы.

Б. Ввиду отсутствия специфического метода расщепления ДНК по остаткам аденина применяется неполное расщепление цепи по пуриновым звеньям. Сравнительный анализ результатов двух типов расщепления (суммарно по пуриновым остаткам и только по гуано зинам) дает возможность дифференцировать олигонуклеотиды, являющиеся продуктами расщепления по А. Для фрагментации по остаткам пурина используется лабильность N-гликозиднои связи пуриновых дезокенрибопроизводных в кислой среде. Д

страница 43
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(29.05.2017)