Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

я с 5'- или З'-конца — они называются 5'-или 3'-экзодезоксирибонуклеазами. Эидоиуклеазы различаются по специфичности — расщепляют определенные последовательности или не предъявляют к последовательности никаких требований. Существуют срерменты, гидролизующие только одноцепочеч-ные ДНК или двухцепочечные ДНК, или те и другие. Наиболее важным классом эидодезоксирибонуклеаз являются рестрикцион ные эидоиуклеазы.

Рестрикционные эидоиуклеазы. Название ре стрикционных эндоиуклеаз (или, сокращенно, рестриктаз) образуется из первой буквы названия рода и первых двух букв названия вида микроорганизма, из которого получен срермент. Например, если источником фермента является Escherichia coli, срермеит называется Eco, Н. influenzae — Hin. Название штамма следует за этими тремя буквами — Hind. Если в микроорганизме содержится несколько ферментов, то они нумеруются римскими цифрами EcoRI, EcoRI I и т. д.

Эти срерменты являются компонентами системы рестрикции — модификации прокариота ческих клеток, которая предназначена для их защиты от чужеродных ДНК. К рестрикционным эндонук-леазам относятся также и все другие ферменты, специфически расщепляющие ДНК по определенной последовательности, хотя часто их роль в процессах рестрикции — модификации не доказана. В зависимости от характера узнаваемой нуклеотидной последовательности («сайта»), мест расщепления и условий реакции рестриктазы делятся на три класса.

Рестрикционные эндонуклеазы первого класса узнают специфическую последовательность ДНК, но расщепляют нуклеиновую кислоту в различных местах, находящихся на неопределенном расстоянии от участка узнавания. Они содержат в одном срермен ном комплексе рестриктирующую и модифицирующую активности и требуют присутствия в среде S-аденозилметионина, АТР и Mg2+.

Ферменты второго класса расщепляют участок ДНК, имеющий ось симметрии второго порядка. К ним относится также несколько ферментов, узнающих несимметричные последовательности и расщепляющих ДНК на некотором расстоянии от участка узиаваиия. Общим свойством рестриктаз этого класса является необходимость

309

Строение нуклеиновых кислот

Берг )Вегд) Пол (р. 1926), американский биохимик. Окончил Пенсильванский университет (1948), с 1959 г.— профессор Стэнфордского университета. Основные работы посвящены генной инженерии, изучению роли тРНК в биосинтезе белка. Впервые получил рекомбинантные молекулы ДНК бактериального вируса лямбда и вируса обезьяны SV-40 Лауреат Нобелевской премии по химии (1980, совместно с У. Гилбертом и Ф. Сенгером)

310

Нуклеиновые кислоты

присутствия в среде только ионов Mg +. Некоторые рестриктазы расщепляют полинуклеотидную цепь так, что в результате образуются фрагменты, содержащие на 5'-коицах выступающие четы-рехзвеиные фрагменты с фосфорилированными 5 концевыми звеньями. Вследствие симметрии расщепляемой последовательности эти тетра ну клеотиды комплементарны друг другу. Они называются липкими, так как могут взаимодействовать друг с другом, образуя совершенные двуспиральные участки. Другие рестриктазы этого класса расщепляют полинуклеотидную цепь с образованием фрагментов, не содержащих одионитевых концевых участков, или структур с выступающими 3 -концевыми однонитевыми участками.

5',,. pNpGpGp ApTpCpCpNp... 3'... pNp CpCpTpApGpGpNp...

.pNpG ...pNp CpCpTpApGp

pGpApTpCpCp Np..

Gp Np.

+

Для рестриктаз третьего класса участок узнавания не обяза тельно должен быть симметричным, а расщепление происходит иа расстоянии 24 — 27 нуклеотидов от участка узнавания. Так же как рестриктазы первого класса, они содержат в одном комплексе и рестриктирующую, и метилирующую активности и требуют для рестрикции присутствия АТР. Пример последовательности, узнаваемой рестриктаэой EcoRl. относящейся к третьему классу, приведен ниже:

5' AG АС С (N)24_25

Известно уже несколько сотен рестриктаз. Часто выделяемые из разных источников ферменты проявляют одинаковую специфичность. Такие ферменты называют изошизомерами.

Дезокснрибонуклеазы 1 и II (ДН а з ы I и И). Дезоксирибонуклеазу I, или панкреатическую деэоксирибоиуклеазу, выделяют из поджелудочной железы крупного рогатого скота. Она расщепляет одно- и двух цепочечные ДНК, давая сложную смесь как моно-, так и олигонуклеотидов с 5'-концами, содержащими фосфатные группы.

Фермент проявляет активность в присутствии ионов Mg2"1 или Мп2+ при оптимальном значении рН среды 7,5. ДНаза 1 неспецифична к последовательности субстрата, однако 'наблюдаются незначительные различия в скоростях расщепления фосфодиэфирных связей, образуемых различными нуклеотидами.

Дезоксирибоиуклеаза II гидролизует ДНК до смеси моно- и олигонуклеотидов, содержащих З'-фосфатные группы, оптимум рН фермента лежит в кислой области.

ДНазы I и II используются для расщепления ДНК с целью получения коротких фрагментов.

Экзонуклеаза Шиз Е. coli. Фермент катализирует последовательное удаление 3 концевых звеньев из двухцепочечных ДНК путем отщепления их в виде 5'-мононуклеотидов

311

Строение нуклеиновых кислот

lllllllllllir

+п<рГ*

ТП

При этом в ДНК остаются одноцепочечные 5'-концевые участки; гидролиз продолжается до тех пор, пока длина двух цепочечного участка в центре гидролизуемой молекулы не уменьшается настолько, что два 5'-концевых фрагменте больше не могут удерживаться вместе. Когда они разделяются, гидролиз останавливается. Экзонуклеаза III используется для укорачивания двухцепочечных фрагментов ДНК.

5'-Э кзонуклеаза из Е. coli, инфицированной бактериофагом L Фермент удаляет нуклеозид-5'-фосфаты, последовательно отщепляя их от 5'-конца двухцепочечных ДНК. В ре-

Смнт (Smith) Хамильтон (р. 1931), американский микробиолог. Окончил Калифорнийский университет в Беркли (1952), с 1970 г.— профессор университета Дж. Гопкинса в Балтиморе. Основные работы — в области генной инженерии. Впервые выделил рестрик-ционную эндонуклеазу Hind 11 (1970), разработал методы определении структуры узнаваемого участка. Лауреат Нобелевской премии по физиологии и медицине (1978, совместно с Д. Невисом и В. Арб ром)

3"

]—3'

* 5' +п (pN)

зультате образуются ДНК с выступающими концевыми участками.

Экзонуклеаза VII из Е. с о 1 i специфична к одноцепо-чечным ДНК и отщепляет небольшие олиго нуклеотиды как с 5'-, так и с З'-концов ДНК.

Применение находит и экзонуклеаза I из Е. coli, гид ролизующая одноцепочечные ДНК в 40 ООО раз быстрее, чем двух-

312 цепочечные. Гидролизу подвергаются только полимеры со свобод-

- ной З'-гидроксильной группой; в результате гидролиза ДНК укора-

Н уклеи новые кислоты чивается с З'-конца путем последовательного отщепления нуклео-

зид-5'-фосфатов. Фермент используется для специфического удаления 3 концевых одноцепочечных участков ДНК.

Следует отметить, что в клетках содержится большое количество дезок и ри бону к л аз, расщепляющих ДНК как по экзо-, так и по эндонуклеазному типу только в присутствии АТР. Многие из них принимают участие в процессах рекомбинации.

Ферменты, расщепляющие РНК. Большинство известных рибо нуклеаз (РНаз) относится к классу фосфотрансфераз— ферментов, катализирующих нуклеофильную атаку 2'-ОН-группы рибозы на атом фосфора фосфодиэфирной связи. В результате на первом этапе реакции образуются олигонуклеотиды, содержащие 2',3'-циклофосфат на З'-конце и нуклеозид-2',3'-циклофосфаты

О II

О—Р—О"

\

сн2 в, о он

I

о=р—о

I

о

+

HOCHi _ »2

о он

I

о=р—о-

I

о

При более высоких концентрациях РНазы циклофосфатные группы раскрываются, образуя З'-фосфатные группы. Процесс раскрытия цик офосфатов может быть осуществлен кратковременной обработкой кислотой; при этом образуются смеси 2'- и 3 монофосфатов Такие рибо ну клев зы относятся к эндонуклеазам.

Рибонуклеаза А специфически гидролизует РНК по пиримидиновым основаниям; конечными продуктами (после расщепления циклофосфатов) являются пиримидиновые нуклеозид-З'-фосфаты и олигонуклеотиды, содержащие 5'-ОН- и 3'-фосфатную группы:

II III

pApGpGpCpUpApGp Up UpGp CpA

313

Строение нуклеиновых кислот

РНаза А

pApGpGpC р + Up -г ApCpU -р+ U ->р t Gp С>Р4 А

РНлзл А

pApGpGpC р 4 U р + ApGpUp + Up + Gp Ср + А

Скорость расщепления различных фосфодиэфирных связей убывает в ряду CpA > UpA ;» СрС :» UpC > CpU > UpU; предпочтительно гидролизуются однонитевые РНК.

Рибонуклеаза Т[ из Aspergillus oryzae осуществляет расщепление РНК по гуаниновым звеньям, образуя гуанозин 3 фосфаты и оли го нуклеотиды, имеющие на 5'-конце гидроксильную группу, а на З'-концах — гуаноэин-3'-фосфат:

Натане (Nathans) Даннзль (р. 192В), американский вирусолог. Окончил университет штата Делавэр (1950), с 1972 г.— директор отдела микробиологии медицинского факультета университета Дж. Гопкинса в Балтиморе. Основные работы — по изучению структуры и функции генома вируса. Впервые с помощью рестрикционных эндонуклваз провел картирование ДНК вируса обезьяны SV-40. Лауреат Нобелевской премии по физиологии и медицине (1978, совместно с Г. Смитом и В. Арбером).

р A pG pG р

С р U р А р Gp U р U рз р

С р А

pApG >р +G ~"P х CpUpApG > р +¦ UpUpG *р + СрА

pApGp+G р 1 CpUpApQ р | UpUpG P т СрА

Так же как и рибонуклеаза А, РНаза Т со значительно большей скоростью расщепляет одноцепочечные поли нуклеотиды; скорость гидролиза убывает в ряду GpC :> GpA > GpG ;> GpU.

314

Нуклеиновые кислоты

Лрбер (ЛгЬег) Вернер (р. 1929), швей царский генетик. Образование получил в Цюрихе, профессор университета и Биоцентра в Базеле. Основные работы посвящены изучению структуры и функционирования вирусного генома. Открыл (1962) ферменты рестрикции и модификации, Лауреат Нобелевской премии по физиологии и медицине (1978, совместно с Д. Натансом и Г. Смитом).

Рибонуклеаза Т2 из A. oryzae при длительном гидролизе РНК расщепляет ее полностью до нуклеозид-З'-фосфатов. При частичном расщеплении РНК образуются преимущественно фрагменты, содержащие на З'-концах аденозин-З'-фосфат.

Рибонуклеаза U из Ustilago sphaerogena преимущественно расщепляет фосфодиэфирные связи, в которых донором З'-ОН-группы являются пуриновые нуклеотиды. т. е. связи RpN; скорость расщепления возрастает в ряду U < С < G < А.

Среди других ферментов, расщепляющих РНК, следует упомянуть рибонуклеазу III из Е. coli, проявляющую абсолютную специфичность к двухцепочечным полирибонуклеотидам. Фермент дает олигонуклеотиды, оканчивающиеся З'-фосфатом.

Ферменты, расщепляющие ДНК и РНК. Известно значительное число ферментов, иеспецифичных к типу углеводного остатка в нуклеиновых кислотах. Так, фосфодиэстеразы, выделяемые из яда змей, гидролизуют олиго- и пол и нуклеотиды начиная с З'-конца, путем последовательного отщепления нуклеозид-5'-фосфатов. Эти ферменты способны катализировать гидролиз одноцепочечных и со значительно меньшей скоростью двуспиральных поли нуклеотидов. Напротив, фосфодиэстеразы из селезенки гидролизуют нуклеиновые кислоты начиная с 5' конца последовательно удаляя концевые звенья в виде нуклеозид-З'-фосфатов. Оба фермента гидролизуют рибо-, дезоксирибо-, олиго- и пол и нуклеотиды и используются для получения моно нуклеотидов.

Большая группа ферментов, неспецифичных к типу углеводного остатка, весьма чувствительна к вторичной структуре и расщепляет только одно цепочечные поли нуклеотиды. Наиболее широко используемыми ферментами такого типа являются нуклеаза S из A. oryzae, нуклеаза из Mung been и нуклеаза из N. crassa. Первые две из них расщепляют одно цепочечные ДНК и РНК в слабокислой среде а присутствии ионов цинка до олиго- и мононуклеотидовс грос-фатной группой на 5'-конце; третья расщепляет поли нуклеотиды в нейтральной и слабоосновной средах, дааая 5'-фосфорилирован-ные короткие олигонуклеотиды.

Эти нуклеазы широко используются для исследования вторичной структуры одноцепочечных участков. В генной инженерии они применяются для удаления однонитевых концевых участков ДНК.

Существует большое число ферментов, способных отщеплять фосфатные группы от моно-, олиго- и полинуклеотидов. Некоторые из них обладают специфичностью в том отношении, что удаляют только 5'- или только 3 -фосфатные группы. Из неспецифичных фосфомоноэстераз, отщепляющих фосфаты вне зависимости от их положения как от моно-, так и от полинуклеотидов, широко используются две фосфомоноэстеразы. Одна из них, так называемая бактериальная щелочная фосфатаза, выделяется из Е. coli, другая из тонкого кишечника телят.

В блочном методе определения последовательности нуклеиновых кислот весьма существенна методология структурного анализа. В одном из возможных вариантов используется полное расщепление полинуклеотидной цепи двумя (или более) ферментами с различной специфичностью. В случае РНК это может быть осуществлено различными рибоиуклеазами, например гидролиз последовательно рибонуклеазой Т,, а затем — панкреатической рибонуклеазой. Структуры полученных олигонуклеотидов сравниваются для поиска перекрывающихся последовательностей. Если это оказывается недостаточным, используется третья РНазз.

Для двухцепочечных ДНК перекрывающиеся блоки получаются путем расщепления двумя или более различными рестрикционными эндонуклеазами. При этом часть исследуемой ДНК гидролизуется одним ферментом и устанавливается структура полученных фраг-

ментов, а затем те же операции повторяются на другой порции ДНК с другим ферментом. Поскольку требование перекрывания приходится сочетать с необходимостью получения сравнительно небольших фрагментов, иногда применяется расщепление несколькими ре трикционными эндонуклеазами одновременно. При этом необязательно устанавливать полную последовательность фрагментов — важно лишь найти «перекрытия». Процесс поиска перекрывающихся блоков изображается специальными схемами, как показано на рисунке 176.

315

Строение нуклеиновых кислот

Рис. 176. Схема применении метода перекрывающихся блоков дли определения последовательности ДНК с использованием рестриктаз.

Tag I Нра II Tag 1 Bsp I

I \ \ • \ I

Bgl II Нра II

Bsp I

Нра II

гидролиз т]

8spl [гидро и за ]

Bgl II

Tag I

Фрагменты ДНК условно обозначены прямоугольниками, верхняя сторона которых представляет собой одну комплементарную цепь, а нижняя сторона — другую. Слева указаны эидоиуклеазы, использованные для получения перекрывающихся блоков. Вверху дана рестрикцией на я карта определяемого фрагмента. Стрелками в прямоугольниках указывается длина расшифрованного участка и направление, в котором определялась последовательность (в данном случае она определялась в направлении от 5'- к З'-концу).

Рис. 177. Перекрывающиеся блоки, получаемые методом неполных расщеплений РНК РНазами А и Т,

-G-U-C-U-A-C-G-C-C-C-A-U-A-C-C-A-C-C-C-U-G-A-A-C-C-C

G-C-C-C-C-A-U-C-U-C-G-U-

316 Как видно на схеме, установленные последовательности пол-

- ностью перекрываются; более того, они определены фактически

Нуклеиновые кислоты дважды — для верхней цепи и независимо для нижней: это служит

гарантией правильности определения полной структуры и позволяет избежать ошибок.

Другой способ получения перекрывающихся блоков предполагает неполное расщепление исследуемого фрагмента (в частности

страница 42
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.10.2017)