Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

тно осноаный катализ, а также нуклео-фильный катализ с образованием реакционноспособного промежуточного соединения. Немалую роль играет и фактор микросреды. Совокупность факторов, вносящих вклад а повышение каталитической активности ферментов, обеспечивает снижение энергети ческого барьера реакции. Согласно получившей весьма широкое признание концепции, снижение энергетического барьера достигается благодаря стабилизации переходного состояния или, точнее, благодаря приближению структуры субстрата а фермент-субстратном комплексе к структуре переходного состояния. Приближение к структуре переходного состояния требует в общем случае затраты энергии; согласно рассматриваемой концепции, необходимая энергия обеспечивается за счет части энергии связывания субстрата с ферментом.

Механизм действия ферментов

Раскрытие с помощью метода рентгеноструктуриого анализа пространственного строения ряда ферментов явилось надежной основой для построения рациональных схем механизма их действия. В одних случаях эти схемы основываются почти целиком иа анализе структуры фермент-субстратных комплексов а кристалле, а в других — используются также результаты исследований по химической модификации фермеитоа, кинетике катализируемых реакций и другие данные. Установление механизма действия ферментоа имеет ключевое значение для раскрытия структурно-функциональных взаимосаязей во множестве биологически активных систем. В данном разделе приведены сведения о механизме действия ряда ферментов; они могут служить иллюстрацией используемых подходов.

Лизоцим. Лизоцим (КФ3.2 I 17) обнаружен в различных тканях животных и растений, он находится, в частности, а слезной жид-

189

190

Белки и пептиды

Рис 96. Первичная структура лизоцима.

кости и яичном белке. Лизоцим функционирует как антибактериальный агент, катализируя гидролиз полисахарида, аходяшего в состав клеточных стеиок ряда бактерий. Этот полисахарид образован чередующимися остатками N-ацетилглюкозамина (NAG) и N ацетилмурамовои кислоты (NAM), соединенными [5-1,4-глико зидной саязью (полисахаридиые цепи сшиты короткими пептидными фрагментами) (рис. 95). Бактериальный полисахарид является весьма сложным нерастворимым соединением, а связи с чем в качестве субстратов лизоцима часто используются хорошо гидро-лизуемые олигосахариды, образованные остатками NAC.

Лизоцим белка куриных яиц образован одной полипептидной цепью, содержащей 129 аминокислотных остаткоа, его молекулярная масса составляет 14 600. Первичная структура лизоцима определена Р. Кенфилдом и А. Лиу в 1965 г. (рис. 96). Высокая стабильность фермента обеспечивается наличием четырех дисульфидных мости коа.

Информация об активном центре и типе каталитического процесса была получена Д. Филлипсом и сотр. а 1965 г. на основе рентге-ноструктурных исследований лизоцима (и его комплексов с ингибиторами). Молекула лизоцима имеет форму эллипсоида с осями 4,5 X 3 X 3 нм; между двумя половинами молекулы находится «щель», в которой происходит связывание о игосахаридоа. Стенки щели образованы аосноаном бокоаыми цепями иеполярных аминокислот, обеспечивающими связывание неполярных структур субстрата, и включают также боковые цепи полярных аминокислот, которые

способны образовывать водородные связи с ациламиниыми и гидро 191

ксильными группами субстрата (рис. °5). Размер щели позволяет -

разместиться молекуле олигосахарида, содержащей 6 остатков мо- Биологическая роль белков носахаридов. Это согласуется с результатами кинетических исследований, в соответствии с которыми скорость расщепления олиго меров NAG скачкообразно возрастает при переходе от тетрасаха-рида к соединениям, содержащим 5 или 6 моиосахаридных остатков. Методом рентгеноструктурного анализа установить характер связывания субстрата, например гексасахарида NAG , не удается, поскольку он гидролизуется. В то же время комплексы фермента с ингибитором трисахаридом NAG стабильны и хорошо изучены. NAG3 связывается в щели на поверхности фермента, образуя водородные связи и ван дер ваальсовы контакты; при этом он заполняет только половину щели, в которой могут связаться еще три моиосахаридных остатка (рис. 97). Невосстанавливающий конец (сахар А) оказывается у начала щели, а восстанавливающий конец (сахар С) — в центральной ее части; остатки Сахаров А, В и С имеют конформацию кресла. Построение модели фермент-субстратного комплекса было основано на предположении о том, что при связывании субстрата NAG реализуются те же взаимодействия, что и при связывании NAG На модели фермента внутри щели были размещены еще три остатка сахара (обозначаемые как остатки D, Ей F); каждый последующий сахар «присоединялся» таким образом, чтобы его конформация была такой же (насколько это возможно), как у первых трех Сахаров. В составе модельного комплекса все остатки Сахаров реализуют эффективные нековалент-ны взаимодействия с боковыми и пептидными группами аминокислотных остаткоа, образующих щель.

При идентификации каталитических групп естественно было сосредоточить внимание на тех из них, которые в фермент-субстратном комплексе находятся около расщепляемой гликозиднои связи и могут служить донорами или акцепторами протонов. Оказалось, что по одну сторону от расщепляемой связи, на расстоянии 0,3нм (от кислорода гликозиднои связи), находится карбоксильная группа Glu-35, а по другую (на таком же расстоянии) карбоксильная группа Asp-52 (рис. 97), окружение их сильно различается. Glu-35 окружена гидрофобными остатками; можно предполагать, что в оптимуме Рн фермента эта группа находится в неионизирован-ном состоянии. Окружение Asp-52 выраженно полярное; ее карбоксильная группа участвует в качестве акцептора водорода в сложной сети водородных связей и функционирует, вероятно, в ионизированном состоянии.

Предложена следующая схема каталитического процесса при гидролизе олигосахарида (рис. 98). Неионизированная карбоксильная группа Glu-35 выступает в качестве донора протона, поставляя его гликозидному атому кислорода между атомом Qi> сахара D и С< сахара Е (стадия общего кислотного катализа); это приводит к разрыву гликозиднои связи. В результате остаток сахара D переходит в состояние карбкатиона с положительно заряженным атомом углерода Qn и принимает конформацию полукресла. Отрицательный заряд карбоксилатной группы Asp-52 стабилизирует карбкатион Остаток NAGa (сахара Е -j- F) диффундирует из области активного центра. Затем в реакцию вступает молекула воды; ее протон переходит к Glu-35, а ОН -группа к атому С,|, остатка D (стадия общего основного катализа). Остаток NAG4 (сахара D + C + B +А) уходит из области активного центра, и фермент возвращается в исходное состояние.

Рибонуклеаза. Рибонуклеаза (РНКаза) (КФ 3.1.4.22) поджелудочной железы быка гидролизует межнуклеотидные связи в РНК около пиримидиновых звеньев, которые при этом остаются этери

192

Белки и пептиды

Рис. 97. Модель комплекса лизоцима с субстратом N АС,. Положение остатков Сахаров А, В и С установлено методом рентгеноструктурного анализа.

фицированными по 3'-положению. Фермент наряду с другими нук-леазами широко используется при анализе структуры РНК.

РНКаза образована одной полипептидной цепью, содержащей 124 аминокислотных остатка, а ее молекулярная масса равна 13 680; в молекуле имеется четыре дисульфидных связи. РНКаза является первым ферментом, для которого была установлена первичная структура. В ходе этих исследований У. Стейн и С. Мур разработали современную методологию определения первичной структуры белков. В 1969 г. Р. Меррифилд с помощью твердофазного метода осуществил полный химический синтез каталитически активной РНКазы (см. с. 145).

На основании результатов исследования ренатурации рибонук леазы (см. с. 105) К. Анфинсен впервые четко сформулировал пред-

193

Биологическая роль белков

^сн' /

сн,

I

NAM © Л°

СН, I

NAG Asp-52

О II

г СН

I

.-•СНз СН, \

© '°

сн, I

-СН

о

II

ЧСН

^CHj

^^гмам__-

\

СНз

Ч ^сн

NH ^

Рис. 98. Схема каталитического процесса при гидролизе олигосахарида лиэоци-

ставление о том, что пространственное строение белка определяется его первичной структурой.

В 1958 г. Ф. Ричарде показал, что в определенных условиях субтилизин расщепляет в РНКазе пептидную саязь Ala-20— Ser-21. Образующиеся фрагменты были названы S-пептидом (остатки I — 20) и S белком (остатки 21 — 124); за счет нековалент-ных взаимодействий фрагменты образуют комплекс, названный РНКазой S. Этот комплекс обладает почти полной каталитической активностью нативного фермента; в изолированном виде S пептид и S белок неактивны. Далее было установлено, что синтетический пептид, идентичный по последовательности фрагменту S-пептида, содержащему остатки с 1 по 13, восстанавливает активность S-белка, однако более короткий пептид, содержащий остатки с 1 по II, такой способностью не обладает. Полученные данные позволили сделать заключение о том*, что соответствующие остатки His-12 или Met-13 (или оба этих остатка) входят в активный центр фермента.

При исследовании влияния рН на активность РНКазы была выяснена важная роль функциональных групп белка с рК 5,2 и 6,8; это позволяло предполагать участие в каталитическом акте

остатков гистидниа. При карбоксиметилировании РНКазы иодаце-татом при рН 5,5, т. е. в условиях, при которых преимущественно происходит модификация остатков гистидина, наблюдалась полная утрата активности; модифицированный фермент содержит I моль карбоксиметильных групп на I моль белка. В результате образуются две монокарбоксиметилированные формы фермента. В одной форме карбоксиметилированным является остаток His-12, а в другой — His-119. Преимущественно модифицировался His-119.

Эти данные позволяли предполагать, что остатки His 12 и His-119 находятся в активном центре и что модификация одного из них препятствует модификации другого.

В результате рентгеноструктурных исследований, проведенных Г. Уикофом и Ф. Ричардсом было выяснено пространственное строение РНКазы S и комплекса РНКазы S с ингибиторами. На рисунке 99 приведено строение РНКазы S. Видно, что молекула имеет форму почки, активный центр локализован в углублении, где находятся остатки His-12, His-119 и Lys-41.

Предполагаемая схема каталитического процесса, осуществляемого РНКазой, дана на рисунке 100. Гидролиз происходит в результате сопряженного действия остатков His-12 и His-119, осуществля-

195

Биологическая роль белков

Рис. 99. Строение рибонуклеазы S. Показано взаиморасположение His-12, His-119 и Lys-41 в активном центре.

196

Белки и пептиды

Антонов Владимир Константинович

(р. 1927), советский химик-биоорганик. Окончил Московский химико-технологический институт им. Д. И. Менделееве (1949), с 1959 г. работает в Институте биоорганической химии им. М М Шемякина АН СССР- Занимается изучением структуры и функции прогеолитических ферментов. Автор книги «Химия протеолиза». Лауреат Государственной премии СССР (1984).

СН2-

8.-H3N_но он ^ .о Ъ о HN^NH I—I

н.*-т|_) ^

Hi,-12

i

сн2—CH2

+ ^CH h3n

__,СНг—

+r=T

0*^T\ HN^NH О О

CH. HOCH^N^-O

1 QT

1

,СН,-СНз—СНз

I . ^

HN^NH

СН HOCH^N^.1

V

Рис. 100. Схема каталитического процесса, осуществляемого РНКаэой.

ющих кислот но-основный катализ. На приведенной схеме указаны стадии каталитического процесса:

1. Субстрат находится в активном центре; His-12 и His-119, а также Lys-41 расположены около отрицательно заряженного фосфата.

2. В результате действия His-12 как основания, акцептирующего протон от 2'-ОН-группы рибозы, и His-119 как кислоты, отдающей протон атому кислорода фосфата, образуется сначала промежуточный комплекс, а затем 2 ,3 циклический фосфат.

3. На место ушедшего продукта поступает вода, отдающая протон His-119, а ОН —фосфату, одновременно протон от His-12 переходит к кислородному атому рибозы, образуется второй продукт, а фермент возвращается в исходное состояние.

Химотрипсин. Химотрипсин (КФ 3.4.21 1) секретируется в фор ме профермента — химотрипсиногена поджелудочной железой позвоночных животных; активация профермента происходит в двенадцатиперстной кишке под действием трипсина. Физиологическая функция химотрипсина — гидролиз белков и лолипептидов. Химотрипсин атакует преимущественно пептидные связи, образованные карбоксильными группами остатков тирозина, триптофана, фенилаланина и метионина. Он эффективно гидролизует также сложные эфиры соответствующих аминокислот. Молекулярная масса химотрипсина равна 25 ООО, молекула его содержит 241 аминокислотный остаток. Химотрипсин образован тремя пол и пептидны ми цепями, которые связаны дисульфидными мостиками. Первичная структура фермента установлена Б. Хартли в L964 г.

Функциональные группы активного центра химотрипсина идентифицированы с помощью необратимых ингибиторов. Остаток Ser-195 был модифицирован диизопропилфторфосфатом и фенил-метилсульфофторидом, а остаток His-57 — Ы-тозил-Ь-фенилала-нил-хлорметилкетоном (см. рис. 89 и с. 171). Двух стадийность процесса химотри пси нового гидролиза была обнаружена при изучении кинетики гидролиза п-нитрофени л ацетата.

197

Биологическая роль белков

Блоу IBlow) Давид Меряин (р. 1931), английский Биофизик. Окончил Кембриджский университет, с 7977 г.— профессор Имперского колледжа науки и технологии а Лондоне. Основные работы — по выяснению пространственной структуры белков методом рентген ©структурного анализа.

Характерной чертой рассматриваемого процесса является образование ковалентного интермедиата — ацилфермента. Ацилируемая каталитическая группа была идентифицирована — остаток Ser-195. Механизм катализа, осуществляемого ферментом, был предложен еще до установления пространственной структуры белка, но позднее был уточнен. В частности, исследования с помощью 1ЙН Д) позволили доказать образование вцилфермента при гидролизе пептидов (В. К. Антонов).

Трехмерная структура химотрипсина с разрешением 0,2 нм была установлена методом рентгеноструктурного анализа Д. Блоу и сотр.

198

Белки и пептиды

Рис. 101. Схема каталитического процесса, осуществляемого химотрипсином.

в 1976 г. Молекула имеет форму эллипсоида с осями 5,4 X 4,0X4,0 нм. Результаты кристаллографических исследований подтвердили пред-положение о том, что остатки Ser-195 и His-57 сближены. На рисунке 101 показан активный центр химотрипсина с фрагментом связанного субстрата. Гидроксильная группа Ser-195 находится на расстоянии 0,3 нм от атома азота имидазольного кольца His-57. Наиболее интересным оказалось то обстоятельство, что атом азота в положении I кольца находится на расстоянии « 0,28 нм от атома кислорода карбоксильной группы боковой цепи Asp 102 и занимает положение, благоприятное для образования водородной связи. Следует отметить, что химические исследования не могли выявить участия Asp-102 в функционировании активного центра, поскольку этот остаток погружен внутрь молекулы. В настоящее время счи-

Ser-195 -CHj—О

н

(и-57 >

J0

Субстрат CHR —Ы— Н

V3

сн,

I

е

О^ ^CHR1

— СНз—о^"с\

CHR—N—Н I

SZH,

н

I

о о

V I

СНз

Ацил фермент

Vм*'

—CHj—О

CHR—N—Н *»«"".»¦ J | продукт

н<

страница 26
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.08.2017)