Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

ной концентре ции ингибитора).

Неконкурентные (обратимые) ингибиторы, как правило, не имеют сходства с субстратом. Они могут обратимо связываться квк со свободным ферментом, так и с ES комплексом и не конкурируют с субстрвтом, т. е. не вытесняют его из комплексе с ферментом. Скорость ревкции в присутствии неконкурентного ингибитора может быть выраженв уравнением

<К„ + IS|> (1 +¦ [11/К) "

Рис. 90. График зависимости обратной скорости — от обратной концентрации

i

1

* Конкурентный ингибитор

1_

в присутствии конкурентного инги- ^ ^ 1

Эффективность неконкурентного ингибирования определяется кон- 1ВЗ

центрацией ингибитора и не зависит от соотношения концентраций -

ингибитора и субстрата. Биологическая роль белков

Тип обратимого ингибирования (конкурентное или неконкурентное) устанавливают определением зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в присутствии ингибитора. Дчн выяснения типа ингибирования и величины К in.i,-ii.'iyются графиками чави hmolth обратной скорости реакции от обратной концентрации субстрата; в случае систем с обратимыми ингибиторами они являются линейными.

При конкурентном ингибированин выражение для величины обратной скорости реакции следующее:

т = ^г + чЬ-" + |" K,w

I

——— в отсутствие и в присутствии конкурентною • IS| .

ингибитора приведены на рисунке 90. Об эффективности связывания конкурентного ингибитору можно судить по величине накюна графика.

При наличии в системе конкурентного ингибитора величина отрезка, отсекаемого на оси ординат ( —^—), не изменяется: в то же время изменяется величина отрезка, отсекаемого на оси абсцисс. Ее значение равно ^т~< гДе Км — кажущаяся величина Км в присутствии ингибитора

Юм KM(1 j- 111 к,) •

откуда следует, что

Ki= км/км- I -

При неконкурентном ингибироаании величина обратной скорости реакции выражается уравнением

v V V„„ ^ V„„ |S|' ^ ^ К/ '

184

Белки и пептиды

Графики зависимости — от

|S|

i отсутствие и а присутствии не-

конкурентного ингибитора приведены на рисунке 91. В присутствии ингибитора величина отрезка, отсекаемого на оси абсцисс, остается постоянной, т. е. величина Км ие меняется. Величина отрезка, отсекаемого на оси ординат, изменяется, она становится

, где VM,KC — кажущаяся величина VM>KC в присут-

равнон — ствии ингибитора

1

1 + II] /к,

из чего следует, что

Активаторы ферментов. Активность некоторых ферментов может увеличиваться в результате их взаимодействия с определенными соединениями — активаторами. В том случае, когда активатор А, саязываясь с ферментом, влияет на саязывание субстрата, выражение для обратной скорости реакции имеет вид, формально сходный с соответствующим выражением для конкурентного ингибирования:

* V„« Т V \

I +

К. 1*1

1 IS |

где К,— константа диссоциации комплексе фермент — активатор. Если саязывание активатора не влияет на саязывание субстрата

(и наоборот), зависимость от -у^у- имеет вид, сходный с соответствующим выражением для неконкурентного ингибирования:

_L + ___L) (| + *J

v V V„„ ^ V_ IS|/ \ 1 т |A|/ "

Рис. 92. Зависимость скорости реакции, катализируемой аспартат-транскарбамо -илазой, от концентрации аспартата; влияние ингибирующего эффектора (СТР — цитидинтрифосфат):

1 — в отсутствие эффекторы;

2 — в присутствии эффектора.

Такой аид активации называют неконкурентным, поскольку при повышении концентрации актиаатора v увеличивается, а К м не изменяется.

Кооперативные эффекты и регуляторные ферменты. Ферменты, имеющие один активный центр, обычно функционируют а соответствии с кинетикой Михаэлиса; при этом график зависимости v от |S| имеет аид гиперболы (рис. 87). Для ферментов с олигомерной структурой, т. е. с несколькими активными центрами, кинетика функционирования не является однозначной.

В том случае, когда находящиеся в различных субъединицах активные центры кинетически независимы, график зависимости v от [S| представляет собой гиперболу: если же между активными центрами имеется аэаимодейстаие (они функционируют кооперативно), график будет иметь сигмоидальную форму. Такой тип функционирования наблюдается у ряда олигомерных внутриклеточных ферментов, выполняющих важные регуляторные функции. В качестве примера иа рисунке 92 приведен график зависимости v от [S] для аспартат-транскарбамоилаэы. При повышении концентрации субстрата скорость реакции возрастает а начале относительно медленно, а затем значительно быстрее; прирост скорости резко уменьшается только перед достижением максимального значения. Благодаря сигмоидальиому характеру зависимости v от |S| оказывается возможным более эффективное регулирование скорости, чем в случае ферментов с «михаэлисовой» кинетикой.

Активность регуляторных ферментоа обратимо модулируется (ингибируется или стимулируется) определенными метаболитами, которые называют аллостерическими эффекторами. Название «ал-лостерические» (от греч. — другой, етересС — простран-

ство) эти эффекторы получили потому, что, как правило, они не имеют структурного сходства с субстратом (или продуктом) реакции, катализируемой соответствующим ферментом. Они связываются не с активным центром фермента, а со специальными участками, которые называют регуляторными центрами. По предложению Ж. Моно, ферменты, активность которых модулируется аллостерическими эффекторами, были названы аллостерическими.

Эффекторы аллостерических ферментов изменяют степень си моидальиости графика зависимости v от |S!. Ингибирующий (отрицательный) эффектор смещает этот график аира во, и он становится более енгмоидальиым; активирующий (положительный) эффектор смещает график в противоположную сторону, приближая его по форме к гиперболе. Влияние иигибирующего эффектора на активность аспартат-траискарбамоилазы показано на рисунке 92.

Влияние рН на активность ферментов. Ферменты, как и другие белки, имеют большое число ионных групп. Изменение состояния ионизации таких групп при сдвиге рН может оказывать сильное влияние на активность фермента В первую очередь это касается групп, участвующих в катализе или в связывании субстрата.

Для каждого фермента имеется определенное значение рН, при котором скорость катвлизируемой реакции максимальна (оптимум рН). В таблице 8 приведены значения оптимумоа рН для некоторых гидролитических ферментов. Видно, что эти значения сильно различаются; так, например, для пепсина оптимум находится при рН 1,5, а для щелочной фосфатазы - 9,0 — 10,0. Большинство ферментов имеют оптимум рН в нейтрвльной облвсти (7,0—8,0).

Влияние темпервтуры на активность ферментов. Согласно закону Ваит-Гоффа скорость химических реакций увеличивается примерно в два раза при повышении температуры на 10 С (коэффициент Qi ). Это правило справедливо также и для ферментативных реакций, однако только а ограниченной области значений температуры. При повышении температуры свыше 40 -— 50 "С происходит ииак-тивация белкового катализатора из-за тепловой денатурации. Следовательно, ферментативные реакции отличаются от реакций, катализируемых соединениями небелковой природы, наличием температурного оптимума. Причиной быстрого падения активности является высокая величина коэффициента Q|0 для процесса тепловой дена-ту рации белка. Следует отметить, что ферменты термофильных бактерий имеют весьма высокий температурный оптимум.

185

Биологическая роль белков

ж-.'

Моно |Monod| Жак Люсьен (1910— 1976). французский биохимик и микробиолог Окончил Парижский университет (1934), работал там же (с 1959 г.— профессор). Совместно с Ф. Жакобом высказал гипотезы о переносе генетической информации и механизме генетической регуляции синтеза белка в бактериальных клетках. Разработал теорию роста и развития бак ер ми доказал возможность управления этим ростом- Лауреат Нобелевской премии по физиологии и медицине (1965, совместно с Ф. Жакобом и А. М. Львовым).

Таблица 8

Оптимум рН действия некоторых гидролитических ферментов

фермент Субстрат Оптимум рН

Пепсин Яичный альбумин 1.5

а-Амилаза солода Кра мая 4.5

Кислая фосфатаза плазмы 2-Глицерофосфат 4.5 - 5,0

а- Глюкоэидаэа «-Метил гпюкоэид 5.4

Уреаза Мочевина 6,4 - 6,9

Трипсин Белки 7,8

Панкреатическая а -амилаза Крахмал 6,7 - 7,2

Карбок нп птидазаА Различные субстраты 7.5

Щелочная фосфатаза плазмы 2-Глицерофосфат 9-10

Аргиназа Аргинин 9,5 - 9,9

186

Белки и пептиды

А ф

сн2 )сн2

СНа -

СН2 Ў

I

-NH-CH-C-NH-II О

Активный центр. Важная особенность ферментативного катализа состоит в том, что фермент образует с субстратом фермент-субстратный комплекс, и химическое превращение субстрата происходит а составе комплекса. В этом комплексе субстрат саязывается с определенной зоной фермента, называемой активным центром; именно а активном центре происходит превращение субстрата в продукт.

Активные центры ферментов имеют ряд общих черт. Так, обычно активный центр занимает относительно небольшую часть молекулы фермента. Кроме того, актианый центр — это трехмерная структура, часто имеющая, как показывают рентгеноструктурные данные, форму щелн или впадины в глобуле фермента. Активный центр формируется аминокислотными остатками, находящимися в различных, обычно значительно удаленных друг от друга участках полипептидной цепи. Условно в актианом центре можно выделить два участка — саязывающий и каталитический. Остатки аминокислот, образующие саязывающий участок, обеспечивают удержание субстрата а активном центре. Именно «архитектура» связывающего участка активного центра фермента определяет его компле-ментариость структуре субстрата, т. е. специфичность фермента. Взаимодействие между субстратом и связывающим участком активного центра осуществляется за счет кооперативного действия сил различной природы. Оно обеспечивается электростатическими и аодородными саязями, гидрофобными и ваи-дер-ваальсовыми взаимодействиями. Вклады этих сил могут быть весьма различными у разных фермеитоа. Примером, показывающим участие электроста тических сил а связывании субстрата, может служить азаимодей-ствие субстрата с активным центром трипсина. В то же время гидрофобные взаимодействия играют доминирующую роль при связывании субстрата а случае химотрипсина. Наконец, примером.

СН;

I I

-NH—СН—С—NH---- ^N\r^° H-N. .О

сн—с

НС N /

о—сн

I \

II

о

/

сн2

I

сн

/ II

о

н сна

Рис. 93. Образование водородных связей при связывании субстрата с рибонуклеа-чой.

иллюстрирующим роль водородных связей, является связывание 187

субстрата с панкреатической РНКазой. На рисунке 93 показаны -

аодородные саязи, образуемые урндиновым фрагментом РНК Биологическая роль белков с группами связывающего участка фермента.

В каталитический участок фермента входят остатки аминокислот, непосредственно участвующие в катализе. Их называют каталитическими группами. В качестве каталитических обычно выступают ионогенные группы.

Одна из главных задач при установлении механизма действия фермента — идентификация функциональных групп его активного центра, в первую очередь каталитических. Наиболее прямой путь — это использование необратимых ингибиторов, селектиаио модифицирующих определенные аминокислотные остатки. В одних случаях модификация каталитических групп оказывается возможной вследствие их высокой реакционноспособности, а друрих она достигается в результате использования ингибиторов, связывающихся в активном центре. В соответствии с этим различают две группы необратимых ингибиторов. Представители первой группы ие имеют структурного сходства с субстратом, но избирательно модифицируют каталитические группы благодаря высокой реакционноспособности последних. В качестве примера можно привести модификацию диизо-пропилфторфосфвтом уникально реакцноииоспособного остатка серина в каталитическом центре химотрипсина (рис. 89). Ингибиторы другой группы являются структурными аналогами субстратов, содержащими реакционноспособные группировки. Эти ингибиторы снвчвлв нековалентно связываются а зоне активного центра, а затем благодаря наличию реакционноспособной группировки модифицируют локализованные и находящиеся вблизи функциональные группы, образуя с ними ковалентные саязи. Рассматриваемый подход известен под названием «аффинного мечеиия», или биоспецифической модификации (см. с. 172).

Наиболее эффективный метод идентификации функциональных групп активного центра рентгеноструктурный анализ. На основе информации о пространственной структуре фермент-субстратного комплекса, взаиморасположении каталитических групп фермента и атакуемой саязи субстрата а ряде случаев удается расшифровать механизм действии фермента.

Причины высокой каталитической активности ферментов

Между срерментативным и химическим катализом принципиальных различий не существует; химические механизмы, лежащие а их основе, сходны. Доминирующей концепцией химического катализа является теория переходного состояния. Эта теория рассматривает только два состояния реагентов — исходное (основное) и переходное — наименее стабильную структуру, образующуюся а ходе реакции. На графике (рис. 94) переходному состоянию соответствует максимум энергии; в таком состоянии химические связи непрерывно разрываются и образуются. Катализатор ускоряет реакцию, снижая величину энергии переходного состояния (энергетический барьер).

Хотя механизмы химического и ферментативного катализа сходны, однако ферменты в условиях нормального давления а вод

Исходно! состояние

Координата реакции

Рис. 94. Снижение энергии активации Е рн нефермента ивном и ферментативном катализе:

— некатализируемая реакция; неферментативный катализ; ферментативный катализ.

ных растворах при 37 "С являются значительно более эффективными, чем обычные химические катализаторы.

За счет чего достигается высокая каталитическая актианость ферментов? Можно аыделить несколько осноаных факторов, которые реализуются благодаря образованию фермент-субстратного комплекса: факторы сближения, фиксации и ориентации. В рамках теории переходного состояния эти факторы в конечном счете снижают энергетический барьер реакции. Связывание субстрата а актиаиом центре обеспечивает сближение атакуемой саязи с каталитическими группами фермента, одновременно достигается фиксация субстрата и его оптимальная для разрыва и образоаания химических саязей ориентация. Кроме того, это фактор изменения кон-формаций фермента и субстрата. Д. Кошланд сформулировал концепцию «индуцированного соответствия», согласно которой при связывании специфического еубстрата происходит такое изменение конформации фермента, которое перемещает каталитические группы в положение, обеспечивающее эффективное протекание катализа. Индуцируемые субстратом иэмеиеиия конформации фермента происходят, вероятно, а пределах тех состояний, которые «разрешены» и для свободного фермента. Концепцию индуцированного соответствия можно рассматривать как развитие представлений Э. Фишера о жесткой матрице, действующей по принципу «ключ замок».

Большое значение для эффективности действия фермента может иметь сопряженный кисло

страница 25
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(28.06.2017)