Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

образованием спирта н СО Стало ясным, что дрожжевой сок содержит сложную смесь ферментов (названную зимазой) и эти ферменты способны функционировать как внутри, так и вне клеток- По словам одного из историков.

появление пузырьков углекислого газв в опыте Бухнеров означало рождение современных биохимии и энзимологии.

Попытки выделить ферменты в индивидуальном состоянии предпринимали многие исследователи, среди которых следует упомянуть Л. Я. Данилевского, Р. Вильштеттера и др. Белковая природа ферментов была однозначно доказана в 1926 г. американским биохимиком Дж. Самнером, выделившим в кристаллическом виде фермент уреазу из семян канавалии В 1930 г Дж Нортроп получил кристаллический пепсин, а затем трипсин и химотрипсин. С этого периода ствло общепринятым утверждение, что все ферменты являются белками.

В конце XIX в. на базе достижений в облвсти исследования структуры органических соединений биологического происхождения появилвсь возможность изучения специфичности ферментов. В это время Э. Фишером было выдвинуто знаменитое положение о необходимое и стерического соответствия между ферментом и субстрвтом; по его образному выражению, «субстрат подходит к ферменту, квк ключ к замку». В начале нашего века были заложены основы исследования кинетики действия ферментов.

Общая характеристика ферментов

Ферменты имеют различные молекулярные мвесы—от 10 ООО до 1 ООО ООО и выше Они могут быть построены из одной полипеп тидной цепи, нескольких полипептидных цепей илн представлять собой сложные (иногда полиферментиые) комплексы. В состав фермента входят и небелковые компоненты, получившие название коферментов (кофакторов),— ионы металлов, небольшие органические молекулы типа витаминов и т. п.

Ферменты являются высокоэффективными катализаторами: они способны увеличивать скорости реакций в миллионы и миллиарды раз. Так, нвпример, уреаза (при рН 8,0, 20 СС) ускоряет гидролиз мочевины примерно в 10 раз.

Ферменты являются высокоспецифичными катализаторами. Они проявляют специфичность в отношении типа катализируемой химической реакции, причем образования побочных продуктов не происходит. Кроме того, они облвдают выраженной субстратной специфичностью и, как правило, высокой стереоспецифичностью.

Классификация ферментов. Ранее при наименовании ферментов за основу брали название субстрата с добавлением суффикса «аза»; так появились, в частности, протеиназы, липазы, карбогидразы. По сходному принципу обозначали ферменты, катализирующие окислительные реакции (дегидрогеназы). Некоторые ферменты получили специальные названия — трипсин; пепсин и др. В настоящее время принята классификация, в которой ферменты сгруппированы в 6 классов в соответствии с типом катализируемых реакций:

1. Оксндоредуктазы (окислительно-восстановительные ревк-

ции).

2. Трансфервзы (реакции переноса функциональных групп».

3. Гидролазы (реакции гидролиза).

4. Лиазы (реакции отщепления групп не гидролитическим путем) .

5- Изпмеразы (реакции изомеризации).

6. Лигазы (ревкцнн синтеза за счет энергии АТР).

177

Биологическая роль белков

Сем не р (Sumner) Джеймс Бетчеллер

(1887—1955), американский биохимик. Окончил Гарвардский университет (1910), с 1929 г.— профессор Корн пп ского университета. Основные работы — в области химии ферментов. Получил первые кристаллические препараты ферментов с высокой биологической активностью, в том числе уре *зу, и доиааал, что они являются белками. Лауреат Нобелевской премии по химии (1946, совместно с У. Стэнли и Дж. Нор рогом)

178

Белки и пептиды

Бухлер iBuchner] Эдуард (1860—1917), немецкий химик- Окончил Мюнхенский университет (1888), с 1893 г.— профессор Кильского, Тюбингенского университетов, затем университетов в Бреслау и Вюрцбурге. Основные работы — ¦ области органической химии и знзимологии. Установил (1897), что процесс брожения может протекать без участия низших организмов (в присутствии дрожжевого сока, содержащего энзим, названный им эимаэой). Лауреат Нобелевской премии го химии (1907).

В пределах классов ферменты группируются в подклвссы и под-подклассы в соответствии с особенностями катализируемых реакций; на этой основе составлена кодовая нумерация (шифры) ферментов и их системвтические названия. Шифр фермента состоит из четырех разделенных точками чисел: первое число означает класс фермента, второе н третье числа — подкласс и подподкласс соответственно, в четвертое число — порядковый номер фермента в его подподклассе. Например, кислвя фосфатаза имеет шифр 3.1.3.2; это означает, что она относится к классу гидролаз (3.1.3.2), подклассу этих ферментов, действующих на сложноэфир-ные связи (3.1.3.2), к подподклассу ферментов, гидролизующих моноэфиры фосфорной кислоты (3.1.3.2), а порядковый номер фермента в данном подподклассе — 2 (3.1.3.2).

Ферменты, катализирующие одну и ту же реакцию, но выделенные из разных видов живых организмов, различаются между собой. В номенклатуре же они имеют общее название и один кодовый номер. Различные формы того или иного фермента нередко встречаются и у одного биологического вида. Для наименования группы ферментов, катализирующих одну и ту же реакцию и находящихся в организмах одного вида, рекомендуется термин множественные формы фермента. Для тех ферментов одной группы, которые имеют генетически обусловленные различия в первичной структуре, используют термин «изоферменты».

Принципы ферментативной кинетики

Определение скоростей ферментативных реакций и исследование влияния на них различных факторов составляют содержание ферментативной кинетики. Кинетические исследования широко используются для определения сродства субстратов и ингибиторов к ферментам, для установления механизма их действия.

К числу главных факторов, влияющих на скорости ферментативных реакций, относятся, концентрация фермента, концентрация

субстрата, присутствие ингибиторов или активаторов. рН и температура среды.

В подавляющем большинстве случвев скорость ферментативной реакции v прямо пропорциональна концентрации фермента |Е]:

v = k|E|.

Один из наиболее важных факторов, определяющих скорость ферментативной реакции,— концентрация субстрата. При исследовании зависимости скорости реакции от концентрации субстрата |S| во многих случаях наблюдается следующая хврактерная картина (рис. 87): при относительно небольших значениях [S| величина v пропорциональна (S| а при достаточно больших |S| величина v приближается к предельному постоянному значению, называемому максимальной скоростью (Ут^)-

На основании анализа зависимости v от [S] Л. Михаэлис н М. Ментен сформулировали в 1913 г. общую теорию кинетики действия ферментов.

Они постулировали, в частности, что ферментативная реакция является двухстадийной. На первой стадии фермент вступвет в быстрое обратимое взаимодействие с субстратом; в результате образуется фермент-субстратный комплекс ES:

Е + S ES.

На второй стадии ES распадается с образованием продукта реакции Р:

Esi Е + Р.

Вторая стадия лимитирует скорость процесса; последняя определяется концентрацией комплекса ES и константой скорости его распада к. На основании этих предпосылок было выведено уравнение, связывающее v и |S] известное под нвзваиием урввне ния Михаэлиса:

к„ + IS I *

где v — начальная скорость реакции, т. е. скорость, регистрируемая в течение периода времени, за который убыль субстрата не превы швет ~10%. В этот период времени скорость реакции можно считать приблизительно постоянной, поскольку, во-первых, убыль суб стрвта невелика, а. во-вторых, концентрация продукта, который в ряде случаев может оказывать ингибирующее действие, незначительна.

В уравнение входят дае постоянные величины: Уткс — максимальная скорость, т. е. скорость реакций в условиях насыщения фермента субстратом, и Км — константа Михаэлисв для исследуемой пары фермент — субстрат.

Легко показать, что для односубстратной реакции, протекающей по схеме:

Е + S , k+l > ES k+J ¦ Е Р,

где к , —константа скорости образования ES, к_, —константе скорости обратного распада ES на Е и S, k 2 — константа скорости распвда ES с образованием продукте Р, уравнение Михвэлиса справедливо и без допущения о том, что на ствдии образования ES устанавливается равновесие и что стадия распада ES с образованием

179

Биологическая роль белков

Нортроп (Northrop) Джон Хоуард

(р. 1891), американский биохимик. Окончил Колумбийский университет (1912), с 1915 г.— в Рокфеллеровском институте медицинских исследований. Основные работы — по изучению механизма и кинетики ферментативных реакций, свойств ферментов. Доказал белковую природу ферментов (1937, наряду с Дж. Сами ром) Впервые выделил в кристаллическом виде химотрипсин, пепсин, трипсин. Лауреат Нобелевской премии по химии (1946, совместно с У. Стэнли и Дж. Самнером).

180

Белки и пептиды

продукта является лимитирующей. При этом Кч может быть выражена через конствнты скоростей отдельных стадий:

Величины Vmukc и Км можно определить по графику зависимо- • сти v от |S| (рис. 87); Умияс находим на графике как предел, к которому стремится v при увеличении [S]. Из уравнения Михвэлиса следует, что при достаточно высокой концентрации субстрата (когда |S|»K„)

т. е. скорость постоянна и максимальна; реакция протекает по кинетическому закону нулевого порядке.

При низких концентрациях субстрата v прямо пропорциональна |S| действительно, при [S] Км по уравнению Михаэлиса оказывается, что

V™.- II

Мижмлмс (Mlcha lis] Леонор

(1875—1949), немецкий химик и биохимик. Окончил Берлинский университет (1896), с 1929 г. работал в Рокфеллеровском институте медицинских исследований в Нью-Йорке. Основные работы посвящены изучению ферментативных реакций. Ввел (1913) константу в уравнение зависимости скорости ферментативного процесса от концентрации субстрата (константа Михаэлиса). Разработал теорию образования фермент-субстратных комплексов (теория Михаэлиса — Ментена, совместно с М. Ментеном).

в таких условиях реакция протекает по кинетическому закону первого порядка. На графике (рис. 87) это соответствует начальному линейному участку.

Для определения величины Км снова обратимся к уравнению Михаэлиса; из него следует, что Км численно равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции равна половине макси-

мальнои; действительно, при условии, что v =-, имеем:

v4.№.]S]

и Км = |S] .

2 Кч + (SI

Для графического, определения Км сначала требуется найти вели чину v = —-—, а затем через соответствующую точку иа ординате провести прямую, параллельную оси абсцисс до пересечения с гра-

фиком; перпендикуляр, опущенный из точки пересечения на ось 181

абсцисс, покажет величину |S|, численно равную Км (рис. 87).----

Более удобно для определения аеличин Vmjk и Км использовать Биологическая роль белков графики линеаризованных форм уравнения Михаэлнса. Одной из таких форм яаляется уравнение, обратное уравнению Михаэлнса:

_|_ = _j__, км I

v V„„c V№ I SI "

его называют ураанением Лайнуивера — Берка. График зависимости — от (рис. 88) представляет собой прямую, имеющую наклон KM/VMa>,c и отсекающую иа оси ординат отрезок, равный ~—, а на оси абсцисс отрезок, равный ——.

Большинство ферментов катализируют реакции с участием даух (или более) субстратов:

А + В т^ч- С + D.

Исследование кинетики таких реакций позволяет определить величины Кч и VHahi для квждого из субстратов; для этого строят графики зависимости скорости реакции От концентрации одного из субстратов при фиксированной (обычно насыщающей) кои центрации другого.

Единицы активности ферментов. Активность препаратов ферментов обычно выражают в международных единицах активности- Активностью, равной одной международной единице, обладает такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в продукт за 1 мин в стандартных (обычно оптимальных) условиях. Удельная активность — это число единиц активности на I мг белка препарата фермента. Удельная активность отражает степень очистки фермента; она максимальна у чистого фермента.

Международный биохимический союз предложил использовать в качестве единицы активности «ката/i (кат); активностью I кат обладает такое количество фермента, которое катализирует превращение 1 моль субстрата в продукт за 1 с. Следовательно, 1 кат = 60- 10h — 6 -10' международных единиц. Рекомендовано использовать также единицу значительно меньшего масштаба — нанокатал (нкат), равную К) кат.

Ингибиторы ферментов. Действие многих ферментов может быть заторможено определенными химическими соединениями —-ингибиторами. С помощью ингибиторов получают ценную информацию о специфичности ферментоа, природе функциональных групп их активных центров и о механизме действия.

По характеру действия ингибиторы разделяют на необратимые и обратимые.

Необратимые ингибиторы химически модифицируют важные для активности функциональные группы фермента Естественно, что после удаления свободного ингибитора путем диализа активность модифицированного фермента не восстанавливается Эффек тивность действия необратимого ингибиторе характеризуется кон ствнтой скорости процессе ингибироввния. В ряде случаев активность модифицированного ферменте можно восстановить, удална присоединившийся необратимый ингибитор путем соответствующей химической реакции; этот процесс принято называть реактивацией.

Примерами необратимых ингибиторов являются диизопропил-фторфосфат (ДФФ) и иодацетамид. ДФФ инактивирует ряд гидролаз (химотрипсин. трипсин, ацетилхолннэстеразу), модифицируя важный для активности этих ферментоа остаток серина (рис. 89). Иодацетамид инактивирует ферменты, функционально значимой группой которых является остаток цистеина (глицеральдегидфос-фатдегидрогеназв, папвин)-

(CHjbOH СН(СН,)2

V

он

СН3 I

--NH-CH—СО-

ССН,)2СН СН(СНз)2

I I

о о

V

' %

о О + HI

I

CHs

—NH-CH-CO---

Рис. 89. Инактивация динзолролнлфтор-фтфатом сериновой протеиназы.

182 Обратимые ингибиторы взаимодействуют с ферментом без об-

-— разоввния коаалентиой связи. После инкубации с обратимым инги-

Белки и пептиды битором активность фермента восстанавливается при удалении сво-

бодного ингибитора путем диализа. Характерная для соответствующей системы степень ингибироаания достигается а общем случае относительно быстро и далее ие зависит от времени, что указывает на наличие равновесия при образовании комплекса ингибитора I с ферментом Е -f- I -*—fc- El.

Константа ингибирования К, при обратимом иигибировании — это константа диссоциации комплекса фермент-ингибитор

Она является величиной, обратной величине сродства ингиби ора к ферменту.

Различаются даа вида обратимых ингибиторов — конкурентные и неконкурентные. Конкурентные ингибиторы по строению обычно сходны с субстратом; они конкурируют с ним за связывание с ферментом Скорость реакции в присутствии конкурентного ингибитора определяется выражением

__УМ.К1 - |S]_

V — Кмп + И| К,) + |s 1

Хврактернвя черта конкурентного ингибироавния состоит в том, что эффективность ингибирования зввисит от соотношения концентраций субстрата и ингибитора (а не от абсолют

страница 24
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(28.04.2017)