Биологический каталог




Биоорганическая химия

Автор Ю.А.Овчинников

ние (°8°о-ная НСООН в присутствии профлавина) или озонолиз (100%-ная НСООН, резорцин).

Бифункциональные реагенты. К бифункциональным реагентам относят химические соединения, содержащие две (обычно одинаковые) пространственно разделенные реакционноспособные группировки. Бифункциональные реагенты широко используются для ковалентной «сшивки» пространственно сближенных участков как одной белковой молекулы, так и двух разных белков, функционирующих веднном комплексе. С помощью таких реагентов изучают третичную и четвертичную структуры белков и выясняют области контактов различных белковых молекул между собой или с другими биополимерами. К бифункциональным реагентам относятся, например, глутаровый альдегид, 'взаимодействующий с аминогруппами, и N замещенные производные малеимида, реагирующие с сульфгид-рильными группами белков.

Менее специфичны алкилгалогениды, способные модифицировать амино-, сульфгидрильиую, а также имидазольную группы, и арнлгалогениды, реагирующие, кроме того, и с фенодьным гидрок-силом.

СООН

О _I О

1—СН]—С—NH—^—NsN—^ NH—С—СН2—1

СООН

2,2'- Диклрбокси-4.4'-ди (иодацет амиде )«jo6«h

Br—СН2

so3h

/ VCH,-Br

Q,0 ДиБром- П-нейлолеулифокислоте 1,5—Дифтор-2,4-днни1роб*нэол

,хх.

Широкое распространение в качестве бифункциональных реагентов находят диимидоэфиры, модифицирующие аминогруппы белков:

nh2 nh/

II II

Н,С—О—С—(Сн2)п—С—О—СН,

п—I, 2. 3. 4. 5. 6

Особую группу составляют реагенты, содержащие дисульфидные связи или другие группировки (эфирные, азо-, сульфоновые), расщепляемые в достаточно мягких условиях (расщепляемые бифункциональные реагенты).

Использование расщепляемых реагентов облегчает процесс 169

идентификации «сшиваемых» с их помощью белков при исследова---

нии топографии многокомпонентных белковых систем. Синтез

и химическая модификация белков и пептидов

Бн сунцинимидньй эфир 3,3-дитио -бис (пропипновой кислоты) л,л'-Дифтор-м,м-динитродифенилсульфои

Биоспецифическая модификация белков

Реакционноспособные аналоги субстратов или других биоспеци фнческих лигандов (гормонов, медиаторов и т. п.) могут преимущественно или даже исключительно взаимодействовать с аминокислотными остатками, расположенными в активном центре фермента или белка-рецептора. В общем случае такие реагенты называются субстратоподобными.

Химотрипсин

^NH

ч Н /^H-NH-|-\J^H'-

N -Т о а и я -L -фв н и л а лен и л ¦ л ормвтан Химотрипсин

His-57

170

Белки и пептиды

Так, например, этиловый эфир Р4-тозил-1_.-фенилаланина является субстратом химотрипсина:

о»-

NH-Tos

|

-СН—СООС.Н.

Аналог этого соединения — N-тoзил-L-фeнилaлaнилxлopмeтaн был предложен в 1963 г. Е. Шоу в качестве специфического ингибитора. Оказалось, что этот реагент селективно алкилирует остаток гистидина (His 57) расположенный в активном центре химотрипсина.

Кош ланд (Koihland| Дэниел Е.

(р. 1920), американский химик-биоорганик. Окончил Калифорнийский университет в Беркли (1941), с 1965 г.— профессор того же университета. Внес значительный вклад в химию белков и изучение механизма действия ферментов. Исследовал молекулярные механизмы поведенческих реакций,

О,

\ vc

NH / ^CH \

СН;

\

сн—сн

.— NH

Hii-57

NH N

..н

н

CHj

I

F—S=0 О

Фенилметилсульфоннлф орид

Химотрипсин

X

о

* / с

\ /

NH—сн \

сн^

o-s=o

NH^NH© о

---NH

СН—сн2

Активным ингибитором трипсина является аналогичный по структуре хлорметилкетон—№тозил-Ь-лизилхлорметан:

Н .С —^ ^— SOy — NH —СН—СОСН ,С1 (CHJ4NH.

Д.Фарни и А. Толу (1963) использовали для исследования активного центра химотрилсинв феннлметилсульфонилфторид. который избирательно реагирует с остатком серина (Ser-195).

Реагенты для биоспецифической модификации белков чвсто содержат эпоксидную и диазогруппы. Так, Б. Хартли (1964) применил для модификации химотрипсина феноксиметилэтиленоксид, специфично взаимодействующий с остатком метионина (Met 192)

171

Синтез

и химическая модификация белков и пептидов

NH—СН

СНт-О

. н

о

I ]]

сн

I

сн, сн2

О s CHs-CH-CH

^СН-СН;

----NH

Ни-57

Феиакси**«ти. этнленонсид

Скоффоне [ScoHone] Эрнеста

(1923—1973), итальянский химик-органик. Окончил университет ¦ Болонье (1946); с 1964 г.— директор Института органической химии • Падуе и профессор (1966) Падуанского университета. Ему принадлежат труды по синтезу природных полипептидов, методам избирательной модификации, выяснению их пространственного строения.

172 Т. К. Хартман (1963) показал, что структурный аналог глута-

- мина — 6-диазо-5-оксо-Ь-норлейцин реагирует с сульфгидриль-

Бепки и пептиды нои группой цистеина в фосфорибозилпирофосфат-амннотрансфе-

разе:

<=н-с^° + _ 'о сн-с^° L

\CH=N=N | | \ |

СНз HS—СН,— СН -> СНа СНS—СН — СН

I + I I + I

" ООС—СН—NH3 NH ~?)ОС—СН—NH i NH

Аналогично метиловый эфир N дивзоацетилфеиилаланииа избира тельно взаимодействует с оствтком аспарагиновой кислоты (Asp-215) в активном центре пепсина, что приводит к полной инактивации фермента.

Частным случаем биоспецифической модификации является фотоаффинная модификация, основанная на использовании произ водного природного лигаида, содержащего фотореактивную группировку. При облучении УФ светом происходит образование свободных радикалов, способных реагировать с самыми различными группировками белковой молекулы (в том числе и с СН-группой) в местах наиболее тесных контактов с лигандом.

В качестве предшественников активированных соединений обыч но применяют разнообразные производные арилазидов и диазо-соединений, генерирующие при фотолитическом разложении нитрены и карбены, соответственно:

Преимущество метода заключается в возможности проводить модификацию на определенном этапе функционирования системы, однако выход «целевых» продуктов взаимодействия, как правило, низок из-за внутримолекулярных перегруппировок радикалов и дру гнх конкурирующих процессов. Поэтому при идентификации продуктов сшивок необходимо использовать радиоактивно меченные фотоаффинные реагенты.

В качестве примера фотоаффинной модификации рассмотрим локализвцию в ДНК-зависимой РНК-полимеразе участков, контактирующих с 5'-коицевой группой синтезируемой РНК. Были отработаны условия, в которых РНК полимераза способна синтьзиро

вать олигонуклеотиды определенной длины, содержащие иа 5'-конце фотореактивную (у азидоанилидную) группу. После облучения светом транскрипционного комплекса (РНК полимераза — ДНК — РНК) в зависимости от длины синтезированного олигорибонук-леотида модифицировались различные субъединицы фермента. В частности, в случае динуклеотида главным образом модифицировалась р1 субъединица а в случае тетрануклеотида — Р'-субъеди-ница (рис. 83). Полученные результаты свидетельствовали о том, что центр связывания продукта изменяется в процессе синтеза РНК (Е. Д. Свердлов, 1980).

173

Синтез

и химическая модификация белков и пептидов

Рис. 83. Фотоаффинная модификация РНК-полимеразы аналогами РНК-продукта.

Топохимические трансформации пептидных систем

Общепринятый путь исследования зависимости между строением и биологическим действием природных пептидов заключается в получении их аналогов заменой одних аминокислотных остатков на другие и в сравнительном изучении биологических свойств синтезированных соединений.

174

Белки и пептиды

Гудмжн (Goodman) мюррен (р. 1928), американский биохимик. Окончил Калифорнийский университет в Беркли (1952); с 1964 г.— профессор Бруклинского политехнического института, а с 1970 г.— Калифорнийского университета в Сан Диего. Область научны» интересов включает синтеэ и конфор-мационный анализ пептидов и белковых систем. Получил ряд важных лекарственных препаратов.

Другой подход основан на модификации молекул с использованием особых приемов и приводит к аналогам нового типа, в которых при радикальном изменении молекулы как системы в целом сохраняются многие стереоэлектронные характеристики природного соединения. Такие аналоги, нередко успешно имитирующие исходный пептид и эффективно взаимодействующие с соответствующим рецептором или иным партнером в биохимическом процессе, называются то ох и ми чески ми (М. М. Шемякин, Ю. А. Овчинников, В. Т. Иванов, 1967).

Примерами могут служить пептиды, полученные изменением направления ацилирования в пептидной цепи — так называемые ретро-изомеры (рис. 84, пара б—г), аналоги, образованные полным обращением конфигурации всех аминокислотных остатков (энантио-изомеры) (рис. 84, пара а — б), и особенно аналоги, сконструированные комбинацией этих двух приемов (ретро энан тио-изомеры) (рнс. 84, пара а — г или а — в, рис. 85). Такого рода модификации касаются как циклических, твк и линейных пептидов, однако в последнем случае для топохимического подобия аналогов необходимо, чтобы N- и С-концевые группы были соответствующим образом блокированы (рис. 86).

К числу топохимических операций следует отнести и циклизацию биологически активных линейных пептидов за счет вмидных, дисульфидных или иных ковалентных связей. Такая модификация

Рнс. 84. Циклопептид А- В С (а), его энантио изомер (б) и ретро-энан-тио-нэомер {в-е). Светлый кружок обозначает асимметрический атом C-L-аминокислотного остатка, затененный — D-остатка.

оказывается особенно эффективной, если предварительно удается доказать, что природный пептид взаимодействует с соответствующим рецептором в свернутой или квазидиклической конформацни. С другой стороны, если полученное циклическое производное обладает высокой биологической активностью, это служит веским аргументом в пользу того, что исходный линейный пептид имеет свернутую «биоспецифическую» конформацию. Особенностью такого рода трансформаций является возможность, при сравнительно небольшом изменении отдельных функциональных групп пептида, зафиксировать с разной степенью жесткости (в зависимости от величины образованного цикла) конформационные характеристики исследуемого соединения, т. е. получить в относительно «замороженном» состоянии одну из предпочтительных конформацни пептидной цепи.

Нельзя не отметить и твкой прием, как замена в природном пептиде амидных связей на близкие им в стереозлектронном отношении сложноэфирные; в случае биологически активных депси пептидов возможна и обратная замена — сложноэфирных связей на амидные, а также комбинация этих приемов.

Наконец, следует упомянуть и возможность модификации целых фрагментов пептида или белка без разрушения его общей биологически активной конформацни: замену отдельных участков полипептидной цепи на углеводородные звенья (—СН*—СНг—СН-...),

175

Синтез

и химическая модификация белков и пептидов

Рис. 85. Гипотетический циклотрипептид Ala—Val—Ser— (светлые линии) и его ретро-энантио изомер D Ala—D-Ser— D-Val— (тёмные линии), совмещенные в пространстве.

взаимную перестановку в молекуле пептида функционально важных фрвгментов или получение биологически вктивных гибридных молекул, сочетающих в себе элементы структур близких по функции природных пептидов. Термин «топохимические аналоги» и в этом случае сохраняет свое значение.

Топохимический принцип трансформации природных пептидов оказался весьма плодотворным при получении интересных в биологическом отношении аналогов пептидных антибиотиков (М. М Шемякин, Ю А. Овчинников), пептидных гормонов (Г. И. Чипенс, Р. Хиршман), нейропептидов (М. Гудмэн) и т. п.

Рис. 86. Трипептид RCO—А —В—С N Н R (а) и его ретро нантио из мер (б). Обозначении кружков те же. что и на рис. 84.

176

Белки и пептиды

Биологическая роль белков

Ферменты

Берцелиус (Berzellus] Йене Якоб

(1779—1848), шведский химик, иностранный почетный член Петербургской АН (1820). Окончил Упсальский университет (1801), в 1807—1832 гг.— профессор Медико-хирургического института в Стокгольме. Один из основателей современной химии, ввел ¦ химию атомистику, составил таблицу атомных масс большинства элементов. Развил основы электрохимической теории впервые распространил основ ные законы химии на органическую химию.

Ферменты — наиболее важный класс белковых веществ, универсальный по своей биологической функции. Ферменты представляют собой специфические и высокоэффективные катализаторы химических реакций, протекающих в живой клетке. Изучение ферментов, их строения, свойств и механизма биологического действия соствв-ляет один из главных разделов биохимии и биоорганической химии. К настоящему времени охарактеризовано несколько тысяч ферментов, свыше тысячи из них получены в индивидуальном состоянии. Для многих сотен белков-ферментов выясненв аминокислотная последовательность, а самые известные из них расшифрованы с помощью рентгеноструктуриого анализа до уровня полной пространственной структуры. Изучение любой проблемы в области познания механизмов жизнедеятельности обязательно связвно с исследованием соответствующих ферментных систем. Кроме того, ферменты широко используются как мощные инструменты при выяснении строения биополимеров и при генио-инженерных разработках. Они находят широкое практическое применение в медицине и пищевой промышленности.

Исторический очерк. Ферментативные процессы известны человеку с глубокой древности. В частности, брожение широко использовалось греками для получения вина (открытие этого способа приписывалось богу Бахусу). Народы многих стран издавна владели искусством приготовления хлеба, сыра, уксуса на основе переработки растительного и животного сырья. Однако современный этап в развитии энзимологии относится к нвчалу прошлого века. В 1814 г. член Петербургской Академии наук К. Кирхгоф установил, что крахмал превращается в сахвр под действием некоторых веществ, находящихся в прорастающих зернах ячменя. Дальнейший шаг вперед в этом направлении был сделан французскими химиками А. Пайеиом и Ж. Пирсо, которые в 1833 г. показали, что термолабильный фактор, получаемый из солодового экстракта путем осаждения спиртом, обладает способностью гндролизовать крахмал; они назвали его диастазой. Вскоре разгорелся спор о природе брожения, в котором участвовали крупнейшие представители естествознания того времени. В частности, Л. Пастер придерживался мнения, что брожение вызывается живыми микроорганизмами и, следовательно, связано исключительно с их жизнедеятельностью. С другой стороны, Ю. Либих и К. Бериар отстаивали химическую природу брожения, считая, что оно связано с особыми веществами, подобными днастазе (амнлазе). Й. Берцелиус в (837 г. показал, что ферменты — это катализаторы, поставляемые живыми клетками. Именно тогда появились термины «фермент» (от лат. fermentatio — брожение) и «энзим» (от греч. ev %v\it\—в дрожжвх). Спор был окончательно разрешен лишь в 1897 г, когда немецкие ученые братья Ганс и Эдвард Бухнеры показали, что дрожжевой бесклеточный сок (полученный при растирании дрожжей с инфузорной землей) способен сбраживать сахар с

страница 23
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

Скачать книгу "Биоорганическая химия" (11.1Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.06.2017)